酶促反應循環煙酰胺型輔酶研究進展

鄭遠迪 惠秀娟

煙酰胺型輔酶作為最為常見的一種輔酶，參與到多種生物體的氧化還原反應中。在體外酶反應的過程中，輔酶的需求量很高，為了節省成本，輔酶循環路徑成為了眾多研究的焦點，本文選取近年來在這方面的研究進展進行總結。

1 介紹

輔酶是一種可以與酶蛋白松散結合的有機小分子，對于促進特定酶反應的過程有十分重要的意義。輔酶Ⅰ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）與輔酶Ⅱ煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP）均為重要的核苷酸類輔酶。煙酰胺型輔酶NAD（P）H作為氧化劑或還原劑直接參與到含有氧化還原酶的酶促反應中，加快了反應速率。

但煙酰胺型輔酶NAD（P）H價格昂貴，輔酶成本往往大于產物收益，因此如何將輔酶進行循環利用是十分重要的課題。NAD+和NADP+為氧化態， NADH、NADPH為還原態， 煙酰胺性輔酶循環再生的基本原理為氧化態輔酶和還原態輔酶通過加氫或脫氫的氧化還原反應相互轉化。

輔酶循環研究目前有酶法，電化學法，光化學法等多種方法。根據分離難易程度，反應動力學以及反應成本等多方面考慮，在反應體系中構建多酶催化從而實現輔酶循環再生的方法最為經濟實惠。

2 煙酰胺型輔酶循環

2.1 NAD+與NADH循環

NAD+參與的氧化還原反應中，起到電子和氫傳遞作用的主要是分子中的煙酰胺單核苷酸（NMN），可結合的酶種類較多，研究意義重大。

Francesco G. Mutti，等人在通過雙酶氫借用級聯將醇轉化為對映體純的胺的實驗中， 選擇了一種高度對映選擇性催化氫化的伯和仲醇，只需要兩個生物催化劑，即ADH和胺脫氫酶（AmDH）。氧化還原自足循環使用銨離子/氨作為氮源并僅產生水作為副產物。級聯僅需要催化量的煙酰胺輔酶，其將氫化物從氧化步驟轉移到還原步驟。該方法已成功地應用于具有反轉構型的光學活性仲醇的胺化，并且在第一步與第二步反應中間實現了輔酶循環。

多酶反應步驟復雜，不局限于一組輔酶循環。Rongsheng Tao 通過由L-蘇氨酸脫氨酶催化的脫氨基后續氫化反應進行L-2-氨基丁酸的生物合成，然后由L-蘇氨酸由L-蘇氨酸與甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶作為NADH再生系統催化的氫化反應。劉珊等人在合成L-2-丁酸的研究中，就在一鍋反應的體系中用到了酮還原酶作為輔酶循環體系的關鍵酶，產物易分離，降低分離成本跟時間。

全細胞催化反應中，也會設計加入輔酶循環系統來完成復雜轉化。W. Brian Whitaker構建重組大腸桿菌，使其可以利用甲醇作為碳源，轉化生成生物量成分和高價值特種化學品。該研究中并未組成完整的閉合環路來循環輔酶，而是在多個酶促反應中，構建多個輔酶利用途徑，從而達到整體輔酶總量的循環。全細胞催化反應不僅反應穩定，而且輔酶跟酶可以附著在細胞器上達到最大利用效率。

固定化酶技術也可用于輔酶循環研究。Jinglin Fu 設計和構建人工搖擺通道多酶復合物與NAD +修飾的分子臂，以轉移兩個脫氫酶之間的氫化物。搖擺臂不僅顯著增強酶活性，而且在復雜環境中提供高特異性。輔酶因子距離擺動臂的距離以及游離度對整個反應進程都有著影響。Muqing Zheng， Zhiguo Su 將谷氨酸脫氫酶（GluDH），葡萄糖脫氫酶（GDH）和輔因子NAD（H）的多酶系統固定在磁性納米顆粒上，在外加磁場中能提高輔酶循環效率和酶穩定性。

2.2 NADP+與NADPH循環

相比于NAD（H），NADP（H）的價格更為昂貴，如果能夠實現高效的循環再生，則能顯著提高反應的經濟效益。由于NAP（H）的應用廣泛程度不如NAD（H），因此研究進展相對較少。

茅佳靈和許琳研究乳酸合成體外代謝途徑時，構建了輔酶ⅡNADP+與NADPH循環。利用反應體系中的乳酸脫氫酶和非磷酸化的3-磷酸甘油醛脫氫酶兩條路線中的酶反應來實現NADP（H）的循環。并且實驗得出結論提高反應體系中NADP+ 初始濃度有利于提高乳酸的產率。

Alexander Dennig 等人研究單取代苯在與三種同時酶的一鍋反應中轉化為對映純的L-酪氨酸衍生物反應。這第一步反應是苯首先通過工程化的P450合酶羥基化。第二部反應中工程化酪氨酸苯酚裂解酶催化C-C-偶聯反應，隨后用丙酮酸和氨作為共底物的酚的不對稱胺化。NADPH輔因子再循環與葡萄糖脫氫酶同時進行。

有的反應關鍵酶就需要用到輔酶促進反應，可在反應中引入第二種酶進行循環反應。Gao， C.Zhang， L的研究構建了由來自氧化葡糖桿菌的NADPH依賴性羰基還原酶（Gox0644）和葡萄糖脫氫酶（GDH）組成的雙酶循環系統，更高效的生產了具有經濟價值的手性化學品（3S）-乙酰膽堿。

輔酶在酶促反應中起著不可忽視的作用，甚至決定了整個反應的引發和走向。在酶促反應中加入其它酶從而達成輔酶循環目的，既能調節反應平衡，達到最大產率，又能降低成本提高經濟效益。但由于多酶反應體系復雜，選取合適的酶構建循環系統成為了今后研究的重點難點。

（作者單位：110000遼寧大學環境學院）