Galectin家族成員對HIV-1感染巨噬細胞凋亡的影響

王永芳，彭卓穎，李　想，叢　喆，薛　婧，魏　強

(北京協和醫學院比較醫學中心，中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京　100021)

HIV-1感染機體后，破壞機體的免疫系統，使感染者喪失抵抗力進而引發全身疾病，最終發展成為艾滋病。雖然抗逆轉錄病毒療法的應用顯著改善了艾滋病患者的生存質量，但仍無法徹底治愈艾滋病[1]。單核-巨噬細胞是HIV-1重要的潛伏感染靶細胞[2-3]，因此誘導單核-巨噬細胞凋亡對治療艾滋病具有重要意義。半乳糖凝集素家族成員(galectins)可以調節細胞與細胞間、細胞與基質間的相互作用、細胞黏附、細胞信號傳導等多種生物學過程，并且某些成員與細胞凋亡密切相關。例如galectin-2、galectin-4誘導外周血單核細胞凋亡[4]；上皮細胞的研究表明細胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)通過COX-2調節galectin-7表達進而誘導caspase-3、caspase-9活化，促凋亡蛋白Bax、Bcl-xs表達量升高從而誘導細胞凋亡[5]；Galectin-8誘導1299 cells非小細胞肺癌細胞凋亡[6]；Galectin-9誘導T細胞、B細胞、單核細胞凋亡等[7]。我們前期研究發現galectin-3通過Endo G的核轉移誘導HIV-1感染的單核-巨噬細胞凋亡[8]，但galectin家族其他成員對HIV-1感染的巨噬細胞的凋亡影響尚不明確。鑒于文獻報道galectin家族成員中galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9與細胞凋亡相關，本文主要研究了它們對HIV-1感染巨噬細胞凋亡的影響。

1　材料和方法

1.1　細胞

人單核細胞系THP-1來自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；人胚腎傳代細胞系293T來自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所。

1.2　主要試劑及儀器

RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司；DMEM完全培養基購自HyClone公司；Annexin V/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；佛波醇肉豆蔻酸酯 (PMA)購自Sigma公司；HIV-1(Clone:11739R5 tropic)全長質粒為 NIH惠贈；重組蛋白galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9均購自R&D公司；polybrene購自Millipore公司；流式細胞儀Accuri C6購自BD公司。

1.3　實驗方法

1.3.1細胞培養

THP-1是懸浮細胞，培養基為包含10%胎牛血清和2%雙抗的RPMI-1640完全培養基，將細胞濃度調整到每毫升5×105～1×106個，在37℃、5% CO2孵箱中培養。

1.3.2不同濃度galectins誘導THP-1細胞凋亡檢測及分組

取旺盛生長期的THP-1細胞每孔5 ×105個細胞在96孔板中培養，實驗組為每孔添加終濃度為1.5、3、5、10 μmol/L的galectin-2；1.5、3、5、10 μmol/L的galectin-4；1.5、3、5、7.5、10 μmol/L的galectin-7；0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L的galectin-8；0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L的galectin-9。對照組為不添加galectin家族成員。在37℃、5% CO2孵箱中孵育細胞6 h，然后獲取細胞用annexin V/7-AAD染色，上機檢測細胞凋亡情況。

1.3.3流式細胞術檢測細胞凋亡

在96孔板中加入200 μL 0.2% β-乳糖，顯微鏡下觀察待細胞解聚后吸入流式管中，加入2 mL預冷的PBS將細胞洗一遍；加入2 mL預冷的1×annexin V binding buffer將細胞洗兩遍；加入100 μL預冷的1×annexin V binding buffer，然后加入3 μL annexin V和3 μL 7-AAD并輕輕混勻后置于室溫下避光孵育15 min；加入300 μL預冷的1×annexin V binding buffer，以200目篩網過濾，在1 h內上機檢測。

1.3.4PMA刺激單核細胞分化為巨噬細胞

取旺盛生長期的THP-1細胞調整細胞濃度為每毫升1×106個，接種于6 cm無菌細胞培養皿中。并在其中加入佛波醇肉豆蔻酸酯 (phorbol myristate acetate, PMA)調整其終濃度為50 ng/mL，培養24～48 h后即可分化為巨噬細胞。

1.3.5制備HIV-1病毒并用其感染巨噬細胞

將NIH惠贈的HIV-1全長質粒(Clone: 11739 R5 tropic)用陽離子脂質體的方法轉染進入293T細胞，轉染后12 h后更換新鮮的培養基，轉染后48 h獲取HIV-1病毒懸液。之后以HIV-1病毒懸液∶細胞培養基=1∶2的比例培養細胞4～5 d后獲取細胞。

細胞轉染前24 h需要接種適量293T在6 cm無菌細胞培養皿中，使其轉染時細胞密度在80%～90%之間為宜；細胞轉染前1 h需要更換新鮮的培養基，在37℃、5% CO2孵箱中培養；將10 μg HIV-1質粒，用稀釋液(0.9% NaCl)稀釋到總體積200 μL，然后輕輕混勻并置于室溫放置；將4 μL VigoFect，用稀釋液(0.9% NaCl)稀釋到總體積200 μL，然后輕輕混勻并置于室溫放置5 min；將稀釋好的VigoFect溶液逐滴慢慢加入到稀釋好的HIV-1質粒溶液中，然后輕輕混勻并將所得到的轉染工作液置于室溫放置15 min；將所得到的轉染工作液逐滴慢慢加入到4 mL 293T培養基中，然后輕輕混勻并在37℃、5% CO2孵箱中培養；轉染后12 h更換新鮮的培養基；轉染后48 h獲取病毒懸液，2000 r/min離心10 min后收集上清并分裝凍存；HIV-1感染巨噬細胞將HIV-1病毒懸液：細胞培養基=1∶2的比例培養巨噬細胞并加入助轉劑polybrene使其終濃度為10 μg/mL，12 h后更換新鮮培養基，更換培養基時用PBS清洗細胞2次，24 h后二次感染細胞，36 h后更換新鮮培養基，在37℃、5% CO2孵箱中培養4～5 d。

1.3.6流式細胞術檢測galectin家族成員誘導巨噬細胞、HIV-1感染的巨噬細胞凋亡情況

取巨噬細胞(THP-1-Mφ)、HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)每孔5 ×105個細胞在96孔板中培養，實驗組為每孔分別添加5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin-4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9，對照組為不添加galectin家族成員。在37℃、5% CO2孵箱中孵育細胞6 h，然后獲取細胞用annexin V/7-AAD染色，上機檢測細胞凋亡情況。

1.4　統計學方法

2　結果

2.1　不同濃度Galectin-2對THP-1細胞凋亡的影響

結果顯示，對照組細胞凋亡率為(1.84±0.35)%，1.5、3、5、10 μmol/L galectin-2誘導THP-1細胞凋亡率分別為(2.85±0.38)%、(8.70±0.61)%、(17.83±0.82)%、(87.60±0.46)%。(圖1)

2.2　不同濃度Galectin-4對THP-1細胞凋亡的影響

結果顯示，對照組細胞凋亡率為(1.97±0.24)%，1.5、3、5、10 μmol/L galectin- 4誘導THP-1細胞凋亡率分別為(4.13±0.52)%、(9.26±1.66)%、(75.97±0.98)%、(97.63±0.55)%。(圖2)

2.3　不同濃度Galectin-7對THP-1細胞凋亡的影響

結果顯示，對照組細胞凋亡率為(4.09±0.47)%，1.5、3、5、7.5、10 μmol/L galectin-7誘導THP-1細胞凋亡率分別為(3.47±0.55)%、(3.76±0.63)%、(4.59±0.78)%、(18.56±0.64)%、(98.08±1.23)%。(圖3)

圖1　不同濃度的galectin-2誘導THP-1細胞凋亡Fig.1　Apoptosis of THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-2

圖2　不同濃度的galectin-4誘導THP-1細胞凋亡Fig.2　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-4

圖3　不同濃度的galectin-7誘導THP-1細胞凋亡Fig.3　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-7

2.4　不同濃度Galectin-8對THP-1細胞凋亡的影響

結果顯示，對照組細胞凋亡率為(1.73±0.21)%，0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L galectin-8誘導THP-1細胞凋亡率分別為(1.74±0.20)%、(2.00±0.06)%、(2.39±0.19)%、(4.57±0.21)%、(27.61±1.30)%、(76.15±2.36)%。(圖4)

圖4　不同濃度的galectin-8誘導THP-1細胞凋亡Fig.4　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-8

2.5　不同濃度Galectin-9對THP-1細胞凋亡的影響

結果顯示，對照組細胞凋亡率為(3.84±0.35)%，0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L galectin-9誘導THP-1細胞凋亡率分別為(3.90±0.24)%、(8.50±0.16)%、(19.61±0.57)%、(90.43±2.98)%、(98.20±0.31)%、(95.20±0.89)%。(圖5)

圖5　不同濃度的galectin-9誘導THP-1細胞凋亡Fig.5　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-9

2.6　流式細胞術檢測Galectin家族成員誘導巨噬細胞凋亡情況

鑒于上述實驗結果，當galectins濃度太高時，細胞幾乎會發生全部凋亡，不利于后續比較未感染組與HIV-1感染組在處理前后細胞凋亡的變化。本文選用5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8和1 μmol/L galectin-9作為適宜濃度分別處理未感染與HIV-1感染的巨噬細胞并檢測其凋亡情況。

針對未感染的單核-巨噬細胞，結果表明，未添加galectin家族成員的巨噬細胞(THP-1-Mφ)凋亡率為(4.39±0.74)%，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9分別誘導巨噬細胞(THP-1-Mφ)的凋亡率為(4.78±0.41)%、(7.21±1.46)%、(3.78±1.03)%、(5.88±2.08)%、(8.10±4.13)%。統計結果顯示，與未添加galectin家族成員的巨噬細胞相比，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8及1 μmol/L galectin-9均對巨噬細胞(THP-1-Mφ)的凋亡作用無顯著性差異(P> 0.05)。(圖6)

圖6　Galectin-2、galectin- 4、galectin-7、galectin-8、galectin-9誘導巨噬細胞(THP-1-Mφ)凋亡Fig.6　Apoptosis in macrophages induced by galectin-2, galectin- 4, galectin-7, galectin-8 and galectin-9

2.7　流式細胞術檢測Galectin家族成員誘導HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡情況

針對HIV-1感染的單核-巨噬細胞，結果表明，未添加galectin家族成員的HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡率為(12.69±1.16)%；5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9誘導HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡率分別為(11.69±0.90)%、(17.45±1.30)%、(32.01±1.30)%、(15.77±1.21)%、(19.27±2.13)%。統計結果顯示，與未添加galectin家族成員的HIV-1感染的巨噬細胞相比，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、3 μmol/L galectin-8及1 μmol/L galectin-9均對HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)的凋亡作用無顯著性差異(P> 0.05)；7.5 μmol/L galectin-7誘導HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)發生大量凋亡，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.001)。(圖7)

注：與對照組相比，***P < 0.001。圖7　Galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9誘導HIV-1感染的巨噬細胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡Note. Compared with the control group,***P < 0.001.Fig.7　Apoptosis in HIV-l-infected macrophages induced by galectin-2, galectin-4, galectin-7, galectin-8 and galectin-9

3　討論

病毒儲存庫的存在是艾滋病難以根治的最大難點，單核-巨噬細胞是HIV-1感染的一類重要的病毒儲存庫。我們前期的研究發現galectin-3通過Endo G的核轉移能夠誘導HIV-1感染的單核-巨噬細胞發生凋亡[8]。本研究結果發現7.5 μmol/L galectin-7能夠誘導HIV-1感染的巨噬細胞發生大量凋亡，且不會誘導未經HIV-1感染的單核-巨噬細胞發生凋亡。在Galectin家族成員誘導HIV-1感染的單核-巨噬細胞凋亡的研究中，我們發現只有galectin-3和galectin-7對于未感染和HIV-1感染的單核-巨噬細胞凋亡存在病毒感染的特異性，而galectin-2、galectin-4、galectin-8和galectin-9并沒有對HIV-1感染發生特異作用。這一結果提示了galectin-3和galectin-7能夠識別HIV-1感染后細胞表面的某些聚糖分子或者識別發生糖基化改變的表面受體，致使其可以區分識別未感染和HIV-1感染的單核-巨噬細胞，進而啟動病毒感染細胞下游分子的凋亡信號通路，最終能夠誘導HIV-1感染的單核-巨噬細胞發生凋亡。

我們的結果發現高濃度的galectins可能由于毒性較大會造成幾乎全部細胞發生凋亡，同時考慮到大劑量galectins的使用濃度不利于臨床應用，因此本文中galectins的適宜濃度為能使細胞發生明顯凋亡的最低濃度。研究結果顯示7.5 μmol/L galectin-7對HIV-1感染的單核-巨噬細胞具有凋亡誘導的特異性作用，但其若實現臨床應用，仍存在劑量過大等問題，對于galectin-7的最佳臨床應用劑量和安全性仍有待大量實驗的檢驗。此外，對于HIV-1感染的單核-巨噬細胞，galectin-7識別的病毒感染特異性作用機制以及啟動的下游凋亡信號通路研究目前正在進行中。綜上所述，galectin-7對HIV-1感染的單核-巨噬細胞凋亡具有重要作用，為清除HIV-1感染的單核-巨噬細胞提供了新思路，有助于清除部分病毒儲存庫，從而為實現艾滋病的功能性治愈奠定理論基礎。