實驗用狨猴微衛星引物篩選及遺傳多樣性分析

滕永康，劉先菊，張　旭，向志光，阮研碩，肖　沖，劉云波

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京　100021)

普通綿耳狨猴(Callithrixjacchus)是一種小型的非人靈長類實驗動物，原產于南美巴西的熱帶雨林，因具有體型較小(成年狨猴體長165～199 mm，體重337～413 g[1])、便于捕捉和固定、飼養成本較低、繁殖效率較高等特點，已廣泛用于神經科學、行為學、傳染病學、生殖醫學、藥物開發及藥物安全評價等研究領域[2-3]。自上世紀80年代引入我國以來，在病毒學[4-5]、免疫學[6-7]、基因工程[8-9]等研究領域應用較多。清晰的遺傳背景是狨猴實驗結果的可靠性、準確性、可重復性、以及科學引種、繁殖和生產的基本保障，而盡快建立狨猴的遺傳質量監測體系更是十分必要和亟待開展的工作。隨著實驗動物科學領域的快速發展，微衛星標記檢測技術已廣泛應用于我國多種實驗動物遺傳背景監測和種群遺傳結構分析，如近交系小鼠及大鼠[10]、封閉群小鼠[11]及大鼠[12]、長爪沙鼠[13]、小型豬[14]等常用實驗動物群體已建立了穩定的微衛星標記檢測方法，包括非人靈長類動物，如恒河猴[15]及食蟹猴[16]，均有相關微衛星標記的遺傳學結構分析報道。而狨猴作為新型的實驗動物，國外研究者Raveendran等[17]、Katoh等[18]相繼開發了狨猴微衛星DNA標記引物，并對狨猴微衛星位點多態性進行分析報道，國內至今尚無報道。鑒于狨猴在生物醫學研究領域諸多學科的重要性，以及狨猴目前仍作為“實驗用狨猴”，尚無國家、行業或地方標準的推出。本文通過篩選驗證得到20對多態性較好的微衛星位點，并就中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物北方資源中心引進的實驗用狨猴群體遺傳結構進行測定分析，為狨猴科學繁育及遺傳質量控制提供數據支持。

1　材料和方法

1.1　實驗動物

成年狨猴30只，年齡2～4歲，體重330～420 g。由中國醫學科學院醫學實驗動物研究所實驗動物北方資源中心[SCXK(京)2014-0011][SYXK(京)2017-0027]提供。溫度24℃～29℃，濕度> 40%，并按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.2　主要試劑及儀器

Easy Pure Blood Genomic DNA Kit(code #EE121-01，全式金)；2×EasyTaq PCR Super Mix(AS111-02，全式金)；100 bp DNA Ladder(code 3422A，TaKaRa)；抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)；PCR儀(MycyclerTMThermal Cycler型，Bio-Rad)；電泳儀(200/2.0 Power Supply型，Bio-Rad)；凝膠成像系統(Tanon-1600型，天能)；遺傳分析儀(3730XL DNA analyzer，ABI)。

1.3　實驗方法

1.3.1樣本采集和基因組DNA提取

狨猴后肢靜脈采血，EDTA-K2抗凝，采血量為每只0.5 mL。用Easy Pure Blood Genomic DNA kit純化基因組DNA。

1.3.2引物篩選及PCR擴增

通過查閱相關文獻，篩選多態性較好的41個狨猴微衛星標記，經NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists)報道及PCR優化后得到了20個狨猴微衛星標記和20對引物，這些標記基因基本覆蓋了狨猴20條染色體上的遺傳概貌，具有豐富的多態性，微衛星標記信息詳見表1。PCR擴增總體系20 μL，其中2×EasyTaq PCR Super Mix 8 μL，模板DNA量1 μL，上下游引物各0.2 μL(濃度：50 μmol/L)，ddH2O 10.6 μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度55℃～60℃ 30 s，72℃延伸30 s，共40個循環；72℃繼續延伸8 min，擴增產物4℃保存。

1.3.3PCR產物鑒定及電泳結果

用2%瓊脂糖凝膠(agrose)電泳，點樣量每孔5 μL，以150 V恒壓30 min進行PCR產物鑒定；再用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，以80 V恒壓1.5 h進行等位基因的分離，上樣量5 μL，用EB緩沖液進行染色，Tanon-1600凝膠成像系統進行成像。

1.3.4STR掃描

一次掃描3個微衛星位點，每3個位點的反向引物分別用ROX、FAM、HEX三種熒光標記物進行標記，標記后的引物再進行PCR擴增，其擴增產物按1∶3∶5體積比混合后取1 μL進行毛細管電泳檢測和遺傳分析儀3730xl DNA analyzer(ABI)掃描分析，通過Genemarker V2.2.0軟件統計等位基因片段大小，并對掃描峰圖進行數據處理。

1.4　統計學方法

群體內遺傳結構分析常采用雜合度和多態信息含量進行分析和評估，將所有樣本的微衛星基因型輸入Popgene1.32軟件，計算不同個體在各個微衛星位點上的觀察等位基因數(observed number of alleles, Na)、有效等位基因數(effective numbers of alleles, Ne)、表觀雜合度(observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity, He)、香隆信息指數(Shannon’s information index, I)及反映哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)的P-val；再用PIC-CALC軟件(Version- 0.6)對每個位點進行多態信息含量(polymorphism information content, PIC)計算。

2　結果

2.1　PCR擴增產物電泳結果

圖1所示，采用No.3樣本基因組DNA擴增的20對狨猴微衛星產物。2%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，經PCR反復優化，擴增產物豐度較高、特異性較好，初步可以觀察到不同微衛星標記擴增片段大小的不同；進一步用6%非變形的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，檢測出各個微衛星不同等位基因的片段大小(圖2)。

2.2　STR掃描結果

篩選的20個狨猴微衛星標記通過PCR擴增，凝膠電泳鑒定豐度較高，初步用非變性聚丙烯凝膠電泳進行分離，顯示出各標記位點不同片段大小的等位基因；進一步STR掃描后，30個樣本在20個微衛星標記均檢測到掃描波峰，不同樣本在各位點標明有效等位基因大小及數量(圖3)。STR掃描可以精確到等位基因片段大小1 bp的差異，圖3是樣本1、5、7、12在微衛星位點Ham26的掃描波峰，圖3A只檢測到1個等位基因波峰，表示樣本為純合子；圖3B～D各檢測到2個等位基因波峰，表明所檢樣本均為雜合子。

注：(M)DL1000 bp marker。圖1　20個狨猴微衛星標記對No.3樣本DNA的PCR擴增結果Note.(M)DL1000 bp marker.Fig.1　The PCR amplification results of 20 marmoset microsatellite markers of the sample No.3

注：(M)DL1000 bp marker。圖2　20個微衛星DNA等位基因片段大小的非變性聚丙烯凝膠電泳分離結果Note.(M)DL1000 bp marker.Fig.2　The allele size and number results of 20 microsatellite DNA separated by the non-denatured 6% PAGE

2.3　種群遺傳多態性分析

2.3.1多態性分析

30只狨猴在20個微衛星位點共檢測147個觀察等位基因，平均每個位點有5～10個，其中CAJA17、Ham65、Ham61均有10個等位基因，CAJA1位點有9個等位基因，表現出較高的多態性，20個座位的平均等位基因數為7.35個，有效等位基因數在2.250～6.383個之間，平均等位基因數4.040個。(見表1)

2.3.2雜合度和多態信息含量

20個微衛星位點的觀察雜合度、期望雜合度、香隆信息指數以及多態信息含量分析結果詳見表2。從表2中可以看出，觀察雜合度最大為0.4667，平均為1.533；期望雜合度在0.1424～0.435之間，平均期望雜合度為0.251；香隆信息指數在1.2242～2.0324之間，平均為1.5949，PIC在0.5365～0.8253之間，平均PIC為0.7053。

2.4　Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

用Popgene1.32軟件計算實驗用狨猴20個微衛星位點的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗的P值，結果P值均大于0.05，即30只狨猴在20個微衛星位點處于Hardy-Weinberg平衡，詳見表2。

表1　狨猴微衛星DNA標記信息

圖3　Ham26對4個樣本的STR掃描結果Fig.3　Results of Ham26 scanning of 4 samples from the marmosets

序號No.位點Loci等位基因數Na有效等位基因數Ne觀測雜合度Ho期望雜合度He香隆信息指數I多態信息含量PIC遺傳平衡P值Hardy-Weinberg1CAJA194.74930.00000.19721.75010.7614>0.052CAJA663.62900.06670.26331.45030.6826>0.053CAJA1064.25530.06670.22201.57960.7296>0.054CAJA1153.14140.00000.30681.31570.6287>0.055CAJA1364.54550.13330.20681.58800.7447>0.056CAJA1463.26090.20000.29491.38670.6498>0.057CAJA17105.17240.23330.17971.98740.7907>0.058CAJA1882.25000.36670.43501.27850.5366>0.059D10qham5164.76190.13330.19661.65910.7589>0.0510Ham15764.10960.06670.23051.52300.7157>0.0511Ham6084.14750.26670.22821.66840.7286>0.0512Ham65103.32100.20000.28931.67870.6804>0.0513Ham18172.30180.46670.42491.22420.5387>0.0514Ham18474.60360.06670.20401.65380.7513>0.0515Ham12584.56850.13330.20561.72390.7519>0.0516Ham10163.56440.13330.26841.45600.6749>0.0517Ham61106.38300.00000.14242.03240.8254>0.0518Ham3273.68100.20000.25931.60620.7023>0.0519Ham10084.56850.13330.20561.74420.7537>0.0520Ham2683.78950.20000.25141.59190.7001>0.05均值7.354.04020.15330.25061.59490.7053>0.05

3　討論

實驗動物是實驗動物科學的重要組成，是生命科學的基礎支撐、活的“精密儀器”，而實驗動物的標準化和動物實驗的規范化研究勢必會成為實驗動物科學的重要工作。在我國，狨猴至今仍被定義為“實驗用動物”，即狨猴作為諸多學科研究用的非人靈長類實驗動物，目前尚無國家、行業或地方標準的推出。眾所周知，健康可用于科學研究的實驗動物，除了要求對其攜帶的病原微生物、寄生蟲進行實施質量控制和監測外，還要求實驗動物具有清晰和明確的遺傳背景。

狨猴是公認的、重要的非人靈長類實驗動物模型，美國國家人類基因組研究機構已大力度投資驗證了狨猴的基因組序列，這對狨猴的基因和基因型分析具有重要意義[3]。微衛星標記存在于大多數原核及真核生物基因組DNA序列，由2～6個核苷酸串聯重復序列構成，物種間和物種個體間的差異及核心序列重復數量的不同，便產生微衛星DNA標記及微衛星DNA的多態性。由于微衛星DNA相對其它分子標記分布廣、信息含量高、多態性豐富、特異性好、操作簡單、且符合孟德爾的共顯性遺傳定律，近年來已廣泛用于實驗動物質量監測及動物群體遺傳結構分析[19-20]。本文通過查閱文獻[17-18]篩選優化了20個狨猴微衛星DNA標記，并對30只樣本進行微衛星DNA擴增和掃描，初步對實驗用狨猴群體進行了遺傳多樣性分析。等位基因頻率作為評估遺傳變異的前提和基礎，是指某一等位基因特定基因座位在所有等位基因中所占的比例，在某一個位點上, 如果它的等位基因頻率最大值< 0.95，通常定義為多態性位點，本文檢測的所有等位基因頻率最高為0.65，表明篩選的20個微衛星位點的遺傳多樣性較好，有效等位基因數是反映群體遺傳變異程度的一個重要指標，如果有效等位基因數與絕對等位基因數越接近，表明該等位基因在群體內均勻分布度就越好，文中涉及的20個微衛星位點，其中D10ham51的有效等位基因數和觀察等位基因數較接近，為1.2381；而Ham65位點的有效等位基因數與絕對等位基因數相差最大，為6.679，表明該位點的等位基因的均勻分布度較差，有可能是繁育過程中人工選擇因素所導致。

群體雜合度表示在被檢測的位點上群體中的雜合子頻率，它是反映群體雜合程度的度量單位，群體平均雜合度的高低反映了群體遺傳的一致性程度，群體雜合度越高，表明該群體的遺傳變異越大，群體遺傳多態性越高良好的種群平均雜合度在0.5～0.7。本文用Popgene1.32軟件計算平均觀測雜合度和平均期望雜合度基本接近，相差范圍僅為-0.05～0.3，表明狨猴群體遺傳變異較小、遺傳一致性較差。而PIC是用以描述微衛星基因座多態性大小的量度單位，Botstein等[21]認為當基因座位PIC > 0.5為高度多態位點，低度多態位點時，PIC < 0.25。本文的20個微衛星基因座位中，PIC范圍在0.5365～0.8253，平均為0.7053，所有的位點均大于0.500，表明20個位點均表現為高度多態性，說明所篩選的微衛星基因座用于狨猴群體遺傳多樣分析較可靠，表明所監測的狨猴群體具有較豐富遺傳多樣性，選擇潛力較大。此外，香隆指數是反映種群均勻性分布的一個重要指標，一般情況下其香隆指數變化在1.5～3之間，本文的20個微衛星基因座位香隆指數平均值為1.594，表明本地狨猴群體分布及群體交配較隨機。

Hardy-Weinberg平衡定律是指在一個群體無限大、個體間進行隨機交配、沒有突變、沒有遺傳漂變的情況下，群體內一個位點上的基因型頻率和基因頻率將世代保持不變，即處于遺傳平衡狀態。Hardy-Weinberg檢驗P值(HWE)> 0.05時，表示該位點在群體中處于Hardy-Weinberg平衡；當0.01

綜上所述，本文從大量的狨猴微衛星DNA座位篩選出分布在不同染色體上20個標記，并隨機抽取30只人工飼養繁殖的實驗用狨猴樣本進行PCR擴增，擴增產物的電泳結果均顯示清晰可見的目的條帶及DNA多態性，表明采用的微衛星標記能夠較好地反映狨猴種群個體間的遺傳多樣性。STR掃描結果經軟件分析顯示，除等位基因均勻度分布度較差、群體雜合度的遺傳變異較小、遺傳一致性較差外，其PIC仍處于高度多態性范圍，即具有較豐富遺傳多樣性，同時香隆指數的平均值進一步表明本地狨猴群體分布及群體繁殖具有隨機性。此外，Hardy-Weinberg檢驗P值也證實了狨猴種群得遺傳平衡狀態。這些結果均反映了狨猴種群遺傳結構的現狀，為狨猴科學繁育及遺傳檢測方法提供了基礎資料。