人羊膜修補硬腦膜的實驗研究

梁斗　吳先良　黃賽　林胤言　鄧忠勇

【摘要】 目的：探討人羊膜修補硬腦膜缺損的可行性和有效性。方法：取健康大鼠60只隨機分為實驗組及對照組，制成硬腦膜缺損模型。實驗組用硬腦膜缺損處用羊膜修補，對照組直接縫合頭皮。觀察術(shù)后腦部刺激癥狀、行為、進(jìn)食、傷口愈合、腦脊液漏及修補材料和腦皮質(zhì)的炎癥反應(yīng)、粘連和假膜形成情況。結(jié)果：兩組組術(shù)后活動、進(jìn)食正常，頭皮切口愈合良好，未見腦脊液漏及皮下積液等異常情況。觀察組術(shù)后早期羊膜與骨窗處軟組織、硬膜邊緣纖維愈合良好，術(shù)后晚期羊膜與骨窗處軟組織融合，羊膜變薄，手術(shù)顯微鏡下難分辨。對照組術(shù)后早期即有頭皮與腦皮質(zhì)粘連。結(jié)論：人羊膜用于修補硬腦膜缺損能恢復(fù)硬腦膜完整性，是一種安全、有效的硬腦膜修補材料。

【關(guān)鍵詞】 人羊膜； 硬腦膜； 修補； 大鼠

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.6.088 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2018）06-0172-03

Experimental Study on Human Amniotic Menbrane for Repairing Dura Mater/LIANG Dou，WU Xianliang，HUANG Sai，et al.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（6）：172-174

【Abstract】 Objective：To investigate the feasibility and effect of human amniotic menbrane for repairing dura mater.Method：Sixty healthy mouse were randomly divided into expetiment group and control group，and to make the dura mater defect model.The expetiment group was repaired with amniotic menbrance，and the control group was direct suture scalp.The brain stimulation symptoms，behavior，eat，would healing，CSF leak and the inflammatoryreaction，adhesion，pseudomenbrane formation of mending material and cerebral cortex were observated in the two groups.Result：The postoperative activities and eating were normal in the two goups，the scalp incision healed well，there was no CSF leakage and subcutanneous fluid accumulation.The amniotic membrane with soft tissue of bone window，dural marginal fiber were well healed at the early stage of operation in the expetiment group.At late postoperation，the amniotic membrane fusion with soft tissue of bone flap，amniotic menbrane thinning，it was difficult to distinguish under an operatin microscope.The scalp and cerebral cortex adhesion occurred early in the control group.Conclusion：Human amnion can repair dura mater defect and restore dural integrity，it is a safe and effective dura mater repair material.

【Key words】 Human amnion membrane； Dura mater； Repair； mouse

First-authors address： The Workers， Hospital of Wuzhou，Wuzhou 543001，China

外傷或顱腦手術(shù)造成的硬腦膜缺損，是引起顱內(nèi)感染、繼發(fā)性癲癇、切口腦脊液漏等并發(fā)癥的重要原因，及時修補受損的硬腦膜、恢復(fù)期完整性，對于保護(hù)腦組織功能、維持神經(jīng)電生理活動和腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及減少并發(fā)癥發(fā)生具有重要的臨床意義。但目前仍缺乏公認(rèn)的良好人工硬腦膜，探討合適的硬腦膜替代材料成為神經(jīng)外科界面臨的重要課題[1]。筆者通過應(yīng)用人羊膜進(jìn)行修補硬腦膜的實驗研究，探討人羊膜為人硬腦膜修補材料的可能性，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 人羊膜的制備與保存 從剖宮產(chǎn)或順產(chǎn)無菌接生獲取胎盤，供體產(chǎn)前血清學(xué)檢查排除含HIV、HBV、HCV及梅毒，產(chǎn)道淋球菌、衣原體陰性。將羊膜與絨毛膜鈍性分離，以0.2%妥布霉素沖洗后置于100%無菌甘油中，并于普通冰箱-4 ℃保存。應(yīng)用前生理鹽水水化15 min。

1.1.2 儀器與試劑 手術(shù)顯微鏡（鎮(zhèn)江公司），電動磨鉆（蛇牌），顯微手術(shù)器械和試劑（氯胺酮）

1.1.3 動物及分組 取健康大鼠60只，雌雄不限，體重100 g左右，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。將動物隨機分為實驗組及對照組，又分為2周、4周、8周、16周、24周組，每組6只，另取5只作對比研究（預(yù)留1只實驗過程死亡增補）。

1.2 方法

應(yīng)用氯胺酮4 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。頭部3‰碘伏消毒后作額頂部頭皮正中切口，縱行切開頭皮，單側(cè)顳頂部顱骨開窗1 cm×1 cm大小，在手術(shù)顯微鏡下，橢圓形剪除硬腦膜和蛛網(wǎng)膜0.8 cm×0.8 cm，不損傷下方的腦皮質(zhì)。硬腦膜缺損處用羊膜修補。修補材料與硬腦膜缺損邊緣用8個0尼龍線、無損傷針間斷縫合。頭皮切口用3個0絲線間斷縫合。對照組剪除硬腦膜和蛛網(wǎng)膜0.8 cm×0.8 cm后縫合頭皮。

1.3 術(shù)后管理及觀察

術(shù)后實驗組和對照組分期分別籠養(yǎng)，應(yīng)用廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供大鼠飼料喂養(yǎng) ，術(shù)后觀察有無腦部刺激癥狀、行為及進(jìn)食有無異常、傷口愈合及有無腦脊液漏發(fā)生。1周后切口愈合縫線自行脫落。

1.4 組織學(xué)檢查

在預(yù)訂日期，大鼠麻醉后將頭顱離斷處死，沿原切口瘢痕切開頭皮，牽開頭皮和顳肌，通過手術(shù)顯微鏡觀查植入物。顱骨切開術(shù)的骨邊緣、羊膜和其下的腦組織作標(biāo)本切片，標(biāo)本固定于10%甲醛中48 h石蠟包埋，切片行蘇木素H伊紅及馬森三色染色，通過顯微鏡檢查，特別關(guān)注修補材料與腦皮質(zhì)的炎癥反應(yīng)、粘連和假膜形成。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

術(shù)后夜間冷凍死亡3只，余下實驗組和對照組大鼠術(shù)后活動、進(jìn)食正常，頭皮切口愈合良好，未見腦脊液漏及皮下積液等異常情況。手術(shù)后實驗組與對照組臨床觀察結(jié)果比較無明顯區(qū)別。

2.2 組織學(xué)檢查

2.2.1 大體標(biāo)本觀察 術(shù)后2周：手術(shù)顯微鏡術(shù)后2周羊膜與骨窗處軟組織、硬膜邊緣已粘連。術(shù)后4周：羊膜與骨窗處軟組織、硬膜邊緣纖維愈合良好。術(shù)后8周：羊膜無變性、未見鈣化及包裹，羊膜與軟膜、蛛網(wǎng)膜無粘連，腦皮質(zhì)正常。術(shù)后16周和術(shù)后24周：羊膜與骨窗處軟組織融合，羊膜變薄，手術(shù)顯微鏡下難分辨。對照組2周后頭皮與腦皮質(zhì)粘連。

2.2.2 鏡下組織學(xué)觀察 兩組鏡下組織學(xué)觀察結(jié)果比較見表1。

3 討論

硬腦膜是一種以膠原纖維為主要成分的不規(guī)則致密結(jié)締組織，作為一道中樞神經(jīng)系統(tǒng)屏障具有保護(hù)腦組織、防止腦脊液漏及維持腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用，創(chuàng)傷、顱腦手術(shù)、腫瘤侵蝕粘連等因素均可硬腦膜缺損，導(dǎo)致癲癇、顱內(nèi)感染、腦脊液漏等并發(fā)癥的發(fā)生，維持硬腦膜完整性、防止相關(guān)并發(fā)癥發(fā)生是神經(jīng)外科手術(shù)中常需解決的問題。在開顱手術(shù)中有相當(dāng)比例的患者需要進(jìn)行硬腦膜缺損修補手術(shù)，為避免術(shù)后腦脊液漏、降低并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險，需要應(yīng)用合適的硬腦膜替代材料進(jìn)行修補[2]。臨床上對于硬腦膜修補材料的要求較高，理想的材料應(yīng)該具有優(yōu)良物理特性如彈性、韌性且能縫合，并在移植后具有良好的組織兼容性，而且不影響組織細(xì)胞在其內(nèi)部生長和代謝，最終新生的組織能有效替代硬腦膜修補材料[3]。目前臨床上常用的硬腦膜修補材料有自體組織修補材料、同種異體材料、異種生物材料及人工合成材料，這些材料各有有缺陷，人工合成材料（包括聚乳酸、聚羥乙酸、殼聚糖等）組織相容性較差，同種異體硬腦膜容易感染病、供體少，且受人類倫理學(xué)限制[4]。

人羊膜在20世紀(jì)初即被用于人體皮膚移植和燒傷的治療，之后運用于角膜重建手術(shù)，圍繞人羊膜作為修補材料的醫(yī)學(xué)研究逐漸開展和深入[5]。人羊膜為胎膜的內(nèi)層，從細(xì)胞滋養(yǎng)層衍生而來，由羊膜上皮、基底膜、致密層、成纖維細(xì)胞層、海綿層等構(gòu)成，含有諸多生長因子，研究認(rèn)為其具有與皮膚相同的防御與屏障保護(hù)作用，能有效防止病原微生物入侵、減少感染[6]。人羊膜由于組織相容性好、抗原性和成本較低等特點而被作為移植修補材料在臨床上得到廣泛應(yīng)用，且來源廣泛，更重要的是羊膜作為胎盤最內(nèi)層在產(chǎn)婦分娩時隨胎盤排出體外，為產(chǎn)婦分娩后的廢棄組織，其獲取無須破壞胚胎，并不涉及人類倫理問題[7]。研究表明樣膜組織不會表達(dá)人白細(xì)胞A、B、C、DR抗原，在異體移植后不會誘發(fā)發(fā)生排斥反應(yīng)，且良好的細(xì)胞與組織相容性使其可作為良好的組織缺損修補材料來應(yīng)用[8]。另有研究顯示羊膜能有效預(yù)防組織創(chuàng)面和肌肉肌腱年齡、促進(jìn)組織和創(chuàng)口恢復(fù)，并可減輕受損神經(jīng)與周圍組織粘連及瘢痕形成，促進(jìn)神經(jīng)纖維再生、減輕免疫反應(yīng)，在外科手術(shù)中可用于組織修補及防止神經(jīng)、組織粘連[9]。此外，崔鳳斌[10]利用新鮮羊膜移植治療角膜穿孔、胡婕等[11]利用低濃度絲裂霉素浸泡羊膜抑制來降低翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)，均取得了較好的臨床療效。

利用羊膜修補硬腦膜的臨床研究報道較少，張念平等[12]將凍干羊膜用于硬腦膜修補，結(jié)果修補熟手所有試驗豚鼠均無異常行為，植入物逐漸講解且被結(jié)締組織覆蓋，與修補處與大腦表明無粘連，術(shù)后90 d修補材料即呈膠原變性、無炎癥細(xì)胞浸潤，提示其是一種安全有效的硬腦膜修補材料。本研究中將健康大鼠進(jìn)行人為處理的硬腦膜缺損后，于缺損處用人羊膜進(jìn)行修補，術(shù)后2～24周連續(xù)觀察修補后動物情況，結(jié)果早期羊膜清楚、部分纖維化、大量巨細(xì)胞淋巴細(xì)胞、可見纖維母細(xì)胞，但腦表面無纖維粘連、輕度水腫，腦組織正常，隨著觀察時間的推移，后期羊膜消失、原位可見疏松纖維組織，腦表面無纖維粘連、少量血管增生、腦組織正常，而對照組后期觀察中發(fā)現(xiàn)動物腦表面纖維粘連、血管增生，結(jié)果提示羊膜可作為硬腦膜修補材料獲得較好的效果。

綜上所述，人羊膜制備簡單、來源廣泛，可促進(jìn)硬腦膜再生、材料可被機體逐漸吸收，可作為硬腦膜較好的修補材料來選擇。

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（收稿日期：2017-09-08）