慢性粒細胞白血病患者骨髓M2型巨噬細胞與白血病干細胞的相關性研究

蘇瓊　宋建新

【摘要】 目的：探討慢性粒細胞白血病（CML）患者骨髓M2型巨噬細胞與白血病干細胞（leukemic stem cells，LSC）的相關性，并明確其意義。方法：采用免疫組織化學染色法檢測CML慢性期（CML-CP）30例、加速期（CML-AP）21例、急變期（CML-BP）15例、經治療后緩解患者44例（緩解組）、未緩解患者7例（未緩解組）及30例缺鐵性貧血患者（對照組）骨髓組織中CD163+的表達變化，比較M2型巨噬細胞在CML患者不同時期骨髓組織中的表達差異；用流式細胞儀檢測相應CML各期CD34+CD38-CD123+ LSC的表達，并與正常對照組進行比較。結果：CML各組患者骨髓中CD163+巨噬細胞有不同程度的表達，與對照組相比明顯增高（P<0.05）。隨著病情的進展，CD163+巨噬細胞的浸潤密度逐漸增高，CML-BP高于CML-AP（P<0.05），CML-AP高于CML-CP（P<0.05），緩解組CD163+均有所降低，但仍高于對照組（P<0.05），未緩解組與CML-BP相比有增高趨勢，但差異無統計學意義（P>0.05）。在CML-CP患者中，CD34+CD38-CD123+細胞明顯高于對照組（P<0.05），隨著病情進展，表達逐漸增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP，且組間差異有統計學意義（P<0.05）；患者經治療完全緩解后，CD34+CD38-CD123+細胞表達有所降低，但仍高于對照組（P<0.05）；未緩解組CD34+CD38-CD123+細胞有增高趨勢，但與CML-BP相比無統計學意義（P>0.05）；經相關性分析，CD163+巨噬細胞浸潤密度與LSC陽性細胞數呈明顯正相關（P<0.05）。結論：M2巨噬細胞在CML患者骨髓中具有較高的浸潤密度，且在CML不同時期浸潤密度不同；CD34+CD38-CD123+細胞在不同時期的CML中均有不同程度表達。M2型巨噬細胞與LSC可能通過直接或間接作用，參與CML的發生、發展及預后。有望為CML的發生、發展機制、治療及預后判斷提供新的思路和理論依據。

【關鍵詞】 慢性粒細胞白血病； 巨噬細胞； CD163+； LSC

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.6.001 文獻標識碼 A 文獻標識碼 1674-6805（2018）06-0001-04

Correlation Study of M2 Macrophages and Leukemic Stem Cells in Bone Marrow of Patients with Chronic Myeloid Leukemia/SU Qiong，SONG Jianxin.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（6）：1-4

【Abstract】 Objective：To discuss the correlation between bone marrow M2 macrophages in chronic myelogenous leukemia（CML） patients and leukemic stem cells（leukemic stem cells，LSC） and to clarify bone marrow macrophages role in CML patients.Method：The expression of CD163+ in bone marrow was detected by immunohistochemical staining in chronic phase（CML-CP） 30 cases，accelerated phase（CML-AP） 21 cases，blastic phase（CML-BP） 15 cases，remission patients 44 cases after treatment，no remission patients with 7 cases and 30 cases of iron deficiency anemia patients.Flow cytometry was used to detect CD34+CD38-CD123+ LSC.Result：There were different expression levels of CD163+ in CML patient bone marrow.Compared with normal control，the expressions in CML patients were significantly high.With the patient progress，CD163+ infiltration density gradually increased.The infiltration density in CML-BP group was higher than that in CML-AP group（P<0.05），the density in CML-AP group was higher than that in CML-CP group（P<0.05），the density in remission patients was low，and was still higher compared with normal control（P<0.05）.There was increase trend in without remission group compared with CML-BP group（P>0.05）.The number of CD34+CD38-CD123+ positive cells in CML-CP patients was significantly higher than in normal control（P<0.05）.With the progress of the disease，the expression gradually increased，the CML-BP> CML-AP> CML-CP，and there were statistical significance between groups（P<0.05）.CD34+CD38-CD123+ cells in completed remission group were decreased and were still higher than normal control（P<0.05）.There was no statistical significance in without remission group compared to AP.After correlation analysis，CD163+ macrophage infiltration density was positively correlated with LSC-positive cells（P<0.05）.Conclusion：Macrophages have higher infiltration density in CML different phases and gradually polarized to M2 macrophages.Infiltration density is different in different CML phages.CD34+CD38-CD123+ are different expression levels in CML different phases.M2 macrophages closely relate to CML occurrence，development and prognosis.It can supply new ideas and theoretical basis for CML treatment and prognosis judgment.

【Key words】 Chronic myelogenous leukemia； Macrophages； CD163+； LSC

First-authors address：The Peoples Hospital of Chuxiong，Chuxiong 675000，China

骨髓微環境是一個有序的復雜結構，不僅提供造血細胞賴以生存、發育及分化的場所，同時其改變也為血液系統惡性腫瘤提供了一個合適的生存空間。巨噬細胞（macrophages）作為骨髓微環境的一重要成分，在炎性組織中主要參與組織重建、炎癥和免疫，保護機體對抗感染及損傷；而在某些特定的細胞因子作用下可活化為具有不同表型和功能的巨噬細胞，參與腫瘤的生存、增殖、浸潤、轉移并與預后不良相關[1]。白血病干細胞（leukemic stem cells，LSC）是白血病患者體內持續存在的一群微量、相對惰性、具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，其在白血病的發生、發展、化療耐藥和復發中起著重要的作用。研究表明，經治療達完全細胞遺傳學緩解的CML患者體內仍殘留有107個左右包括LSC在內的白血病細胞，這些微小殘留LSC是CML不能被最終治愈和復發的根本原因[2]。因此如何恢復患者機體乃至骨髓微環境的免疫功能，可能是抑制LSC增殖，清除白血病微小殘留，最終治愈白血病的有效方法之一。本文通過免疫組織化學染色，觀察初診CML慢性期（CML-CP）、加速期（CML-AP）、急變期（CML-BP）、緩解及未緩解患者骨髓微環境中CD163+（M2）型巨噬細胞浸潤程度；以CD34+CD38-CD123+作為識別LSC的免疫表型，利用流式細胞術檢測不同時期CML患者骨髓中是否存在免疫表型為CD34+CD38-CD123+的LSC，探討骨髓微環境中浸潤的巨噬細胞類型變化、浸潤密度與LSC的相互關系及在CML發生、發展的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

66病例均來自筆者所在醫院血液科門診及住院患者，男42例，女24例，中位年齡56歲（18～78歲），經骨髓細胞形態、細胞遺傳學及分子生物學檢查，符合文獻[3]CML各期的診斷標準。其中，CML-CP 30例，CML-AP 21例，CML-BP 15例（6例為急淋變，其余為急髓變）。經治療后完全緩解44例，未緩解7例，其中，CML-CP除7例失訪外全部完全緩解，21例CML-AP患者中，完全緩解13例，未緩解3例，5例轉外院治療而失訪；CML-BP完全緩解8例，未緩解4例，治療中1例死亡，2例轉外院失訪。30例缺鐵性貧血患者作為對照組，其中，男18例，女12例；中位年齡54.5歲（18～76歲）。本研究獲筆者所在醫院倫理委員會批準，并征得所有受試者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器

鼠抗人CD163單克隆抗體，SP免疫組化試劑盒購自美國Abcam公司；CD45-ECD、CD34-PE-Cy5、CD123-PE、CD38-FITC及同型對照購自BD公司。流式細胞儀為Beckman Coulter公司 FC500。

1.3 免疫組化檢測CD163+在骨髓組織中的表達

常規骨髓穿刺取骨髓組織，置于10%福爾馬林液固定液中交筆者所在醫院病理科進行脫水、石蠟包埋處理。取骨髓活檢組織的石蠟塊，切3～4 μm厚的切片；采用S-P免疫組化染色檢測CD163+的表達。染色步驟為：二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，3%雙氧水滅活內源性過氧化酶，PBS緩沖液輕洗3次，進行抗原微爐熱修復，正常山羊血清封閉、滴加一抗，4 ℃孵育過夜；PBS緩沖液輕洗3次，滴加二抗，室溫孵育10 min，PBS緩沖液輕洗3次；滴加DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間在10～15 min，自來水沖洗，蘇木素復染胞核，脫水透明，中性樹膠封片。對照組用PBS替代一抗，其余步驟相同。

1.4 免疫組化染色結果判定

巨噬細胞體積較大，形態多樣，呈類圓形或不規則形，偶見有多核細胞；經染色CD163+主要在細胞膜著色，有黃褐色或棕黃色沉著物為陽性。先在低倍鏡（×100）下選取5個染色較好的視野，后在高倍鏡下（×400）計數陽性細胞數[4]，取其平均值進行統計學分析。

1.5 LSC表型檢測

采用細胞直接標記方法，取初診CML患者骨髓2 ml，EDTA抗凝備用。調整待測樣品白細胞計數在（1.0～2.0）×105/L，用微量移液器吸取EDTA抗凝的新鮮骨髓各100 μl于2支流式細胞儀專用試管中，一管是同型對照管，另一管是測定管；于對照管中加入IgG1-PE、IgG2a-FITC、IgG1PE-Cy5、CD45-APC四個抗體各20 μl。測定管加入CD34-PE-Cy5、CD123-PE、CD38FITC、CD45-APC四種個抗體各20 μl，搖勻，室溫下避光孵育30 min。每管加入1×溶血素2 000 μl，搖勻，避光10～15 min至完全溶血。溶血后，每管加入1×PBS 1 000 μl混勻，1 500 r/min離心8 min，棄上清液；加入500 μl PBS搖勻上機測定，每管收集10 000個細胞。

1.6 白血病干細胞的確認

用側向角散射光SSC/CD45設門，將細胞分出淋巴細胞、單核細胞、成熟粒細胞、幼稚細胞群，再以SSC/CD34設門后分析CD34+細胞中CD38-CD123+抗原的表達百分比。所得的百分比數值乘以之前所測得的CD34+細胞的百分比值即為CD34+CD38-CD123+占所有有核細胞的百分比[5]。

1.7 統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行分析。數據以（x±s）表示，各組中CD68、CDl63浸潤密度及LSC陽性表達率用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。應用Pearson分析CD163+與LSC的相關關系，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CD163+在對照組及CML中的表達

本組所有病例的骨髓組織中均可見M2型巨噬細胞浸潤，在骨髓組織中均可見細胞膜或/和細胞漿著色的CD163+的M2型巨噬細胞浸潤。對照組骨髓中可見巨噬細胞稀疏散在浸潤，數量少，見圖1。

2.2 CD163+在各組中的表達

CD163+在對照組、CML-CP組、CML-AP組、CML-BP組、緩解組、未緩解組中均有不同程度的浸潤。經統計學分析，CD163+CML各期中的表達明顯高于對照組（t=17.20、34.54、57.26、6.01、11.27、57.40，P<0.05），CML-BP組患者表達高于CML-AP組，CML-AP組明顯高于CML-CP組（t=22.50，17.71，P<0.05），緩解組明顯高于對照組（t=46.12，P<0.05），未緩解組與CML-BP相比有增高趨勢，但差異無統計學意義（t=0.19，P>0.05），見表1。

2.3 CD34+CD38-CD123+在各組中的表達

CD34+CD38-CD123+在對照組、CML-CP組、CML-AP組、CML-BP組、緩解組和未緩解組中均有不同程度表達，見圖2。經統計學分析，CML-CP明顯高于對照組（t=21.45，P<0.05），隨著病情進展，CD34+CD38-CD123+細胞表達逐漸增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP，且組間比較差異有統計學意義（t=20.46，20.54，P<0.05）。患者經治療完全緩解后，CD34+CD38-CD123+細胞表達有所降低，但仍高于對照組（t=2.86，P<0.05）；未緩解組CD34+CD38-CD123+細胞有增高趨勢，但與CML-BP組相比無統計學意義（t=0.57，P>0.05），見表1。

2.4 CD163+巨噬細胞浸潤密度與LSC相關性

在CML-CP、CML-AP、CML-BP、緩解組、未緩解組中，LSC與CD163+巨噬細胞浸潤密度間呈顯著的正相關關系（r=0.863、0.938、0.905、0.916、0.914，P<0.01）。

3 討論

巨噬細胞是一類廣泛分布于體內動態的、非均質的、具有遷移性的細胞群體，是機體免疫系統的重要組成部分；在不同微環境作用下，巨噬細胞可極化為具有不同分子特征和功能特征的亞群，即M1型或M2型，對腫瘤發生、發展起著截然相反的作用[6-7]。M1型巨噬細胞具有抗原提呈和吞噬腫瘤細胞等細胞毒性效應，而M2型巨噬細胞可通過自分泌、旁分泌途徑參與腫瘤細胞的惡性增殖、抵抗凋亡及侵襲和轉移，又被稱為腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAMs）。已有研究表明CD163+是識別M2型巨噬細胞的標志物[8]。

LSC是指存在于白血病患者體內的一群極微量的細胞，這些微量的細胞通常處于相對靜止的非增殖狀態（G0期）。但因其具有強大的自我更新和分化能力，對白血病的發生、發展、不能被治愈及易復發起至關重要的作用[2]。對于LSC的標志研究已證明，CD123是目前公認的可以從正常造血干細胞（HSC）中識別LSC的一個標記，即CD34+CD38-CD123+僅表達于LSC的表面而HSC不表達[9-10]。本研究應用CD34+CD38-CD123+作為慢性粒細胞白血病患者LSC的標記，檢測CML不同時期LSC的表達情況。

已有研究表明，在慢性粒細胞白血病患者骨髓微環境中均有M2型巨噬細胞的浸潤，其在數量和功能上均占據優勢，且隨著疾病的進展陽性細胞數逐漸增高[11]。本文通過對CML患者不同時期骨髓巨噬細胞及LSC的研究發現，在CML各組患者骨髓組織中CD163+均高表達，且隨著疾病的進展陽性細胞數逐漸增高。LSC在對照組中幾乎檢測不到，而在CML各組中均檢測到有LSC的存在，而且隨著病情的進展逐漸增高，即CML-BP>CML-AP>CML-CP>對照組。通過對CD163+與LSC的相關性分析發現，隨著M2型巨噬細胞浸潤密度的不同，LSC也發生相應的變化；M2型巨噬細胞浸潤密度越高，LSC表達越高，即M2型巨噬細胞浸潤密度與LSC的陽性細胞數呈正相關。提示CML患者骨髓微環境中M2型巨噬細胞的增多，可能是LSC為逃避巨噬細胞的殺傷作用，分泌大量細胞因子如CCL2、VEGF、TGF-β等，將外周血單核細胞大量招募進入骨髓后分化為巨噬細胞，并“迫使”巨噬細胞活化表型及功能朝著有利于LSC發展的M2型轉化，從而進一步增強了LSC的惡性生物學行；而M2型巨噬細胞本身也能分泌大量的CCL2、IL-10、TGF-β和VEGF，通過正向反饋進一步促進巨噬細胞的招募與極化[12-13]；M2型巨噬細胞通過自分泌、旁分泌途徑參與LSC的惡性增殖、抵抗凋亡及侵襲，導致CML的發生、發展。但鑒于CML發病的多因素性和巨噬細胞及LSC調節機制的復雜性，對于CML患者骨髓中的巨噬細胞是來源于外周血、其他組織還是骨髓源性的或幾者兼有及對LSC的調控機制還有待進一步研究。結果還顯示，CML經治療完全緩解后CD163+及LSC表達水平較有所降低，但仍高于對照組，說明CML經治療后雖達到了形態學及基因水平的緩解，骨髓微環境仍未恢復正常，還存在復發的因素。所以在CML緩解后，如何恢復患者機體乃至骨髓微環境的平衡，可能是最終清除白血病微小殘留的途徑之一。例如，如何阻止CML患者骨髓微環境中巨噬細胞的招募、如何阻止巨噬細胞被極化為M2型，或者如何將M2型巨噬細胞逆轉為M1型等都是今后值得研究的課題。

總之，在CML患者骨髓微環境中巨噬細胞的大量浸潤且被極化為M2型，M2型巨噬細胞與LSC數具有明顯的正相關關系，說明M2型巨噬細胞在CML患者骨髓中可以促進LSC的增殖、分化；有望為CML的發生，發展機制、治療及預后判斷提供新的思路和理論依據。

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（收稿日期：2017-07-31）