小分子熱休克蛋白Hsp16.3參與介導結核分枝桿菌致巨噬細胞凋亡的研究進展

黃丹丹

川北醫學院基礎醫學院，四川南充 637007

結核病是世界范圍內亟待解決的問題之一[1]。雖然目前聯合藥物治療對結核病的蔓延有一定抑制作用，但結核病仍然是全球造成死亡的十大疾病之一。相關學者通過對感染結核分枝桿菌（MTB）的肺巨噬細胞進行蛋白質組學分析，發現在235種蛋白質中，絕大多數異常表達的蛋白質都參與細胞凋亡、氧化磷酸化等生物學過程，證實了細胞凋亡在結核病的發生發展過程中扮演了重要的角色[2]。但另一方面，大量研究表明，MTB感染巨噬細胞后，可延緩凋亡途徑[3-4]。Jee B等證實，在小分子熱休克蛋白家族中，Hsp16.3可介導MTB在巨噬細胞內穩定生長，并延遲、減少巨噬細胞凋亡[5]。因此，明確Hsp16.3在MTB中的具體作用，以及其對巨噬細胞凋亡的影響和具體機制，對臨床靶向治療藥物開發具有重要意義。

1 Hsp16.3蛋白分子結構及功能

Hsp16.3分布于MTB，由144個氨基酸組成，分子量約為16kDa，與ESAT6、CFP10等并稱為Mtb相關抗原。正常情況下，細胞內少有或檢測不到該蛋白表達。Hsp16.3可與巨噬細胞內蛋白結合，抑制巨噬細胞凋亡，從而增加Mtb的細菌內穩定性與生存率。Hsp16.3的C端由3部分組成，分別為C端尾（CTT），IXI模體與C端擴展區（CTE）。CTE主要介導蛋白低聚化解離與輔助增強Hsp16.3的分子伴侶功能。

Alok Kumar Panda等通過CTE基因敲除發現，CTE敲除后蛋白低聚化解離活性與Hsp16.3的分子伴侶功能均有所降低。見圖1。

圖1 Hsp16.3蛋白分子結構及功能

2 Hsp16.3介導MTB致巨噬細胞凋亡的作用及其發生機制

2.1 Hsp16.3介導MTB致巨噬細胞凋亡的作用

巨噬細胞凋亡是機體自我防御機制之一，其可有效促進MTB抗原暴露，向樹突狀細胞提成抗原，并促進T細胞活化，誘導免疫應答。巨噬細胞凋亡還能抑制MTB在體內的播散，激活未感染巨噬細胞，增強機體對MTB的殺傷力。在感染晚期，MTB增殖數量增多，MTB自身毒力因子、毒素等分泌增強，均可增加MTB抗凋亡能力，延緩巨噬細胞凋亡進程。

Hsp16.3可抑制巨噬細胞凋亡，增加Mtb的細菌內穩定性與存活率。庹清章等證實，在MTB感染早期、晚期，Hsp16.3的表達可有效抑制巨噬細胞凋亡。庹清章等[6]建立小鼠的感染模型，將MTB H37Rv Hsp16.3基因缺失強毒株注入小鼠體內，并與對照組比較，發現在感染早期、晚期，巨噬細胞凋亡率Hsp16.3基因未缺失組較Hsp16.3基因缺失組顯著增高，且Bcl-2與Caspase-3也有顯著增高。說明在MTB感染早期、晚期，Hsp16.3的表達可有效抑制巨噬細胞凋亡。劉云霞等[7]通過流式細胞技術發現，MTB感染巨噬細胞后，巨噬細胞內Hsp16.3蛋白表達增多。姚楠等[8]進一步研究發現，MTB致巨噬細胞凋亡的程度與Hsp16.3蛋白表達水平與MTB菌株毒力有關。MTB菌株毒力較弱時，巨噬細胞易發生早期凋亡。Hsp16.3蛋白表達水平較高且MTB菌株毒力較強時，巨噬細胞凋亡顯著減少。在MTB隱性感染中，Hsp16.3也介導了MTB在細菌內穩定繁殖與免疫力低下時MTB激活。此外，Shi CH等[9]發現Hsp16.3蛋白可顯著增高MTB菌落形成單位的數量，進一步證實Hsp16.3蛋白對MTB生長繁殖的重要性。

2.2 Hsp16.3介導MTB致巨噬細胞凋亡的機制

Hsp16.3介導MTB致巨噬細胞凋亡的機制目前尚不十分清楚，該進展歸納總結了4種可能的調控機制，見圖2。

圖2 Hsp16.3介導MTB致巨噬細胞凋亡的機制

2.2.1 Hsp16.3抑制微管結合蛋白LC3的表達 Shi CH等[9]證實，Hsp16.3抑制微管結合蛋白LC3的表達，進一步影響細胞凋亡的過程。LC3在細胞自噬或凋亡過程中具有識別與連接作用，當自噬或凋亡過程發生時LC3蛋白轉變成LC3-II，并介導溶酶體與細胞識別，促進凋亡過程。Hsp16.3抑制LC3表達后，細胞質量控制（Quality Control）出現異常，巨噬細胞凋亡過程顯著下降[10]。

2.2.2 Hsp16.3促進miR-181a與miR-146a降解Qing-Lin Meng等[11]利用U937細胞系作為體外巨噬細胞模型，通過對MTB感染巨噬細胞中mRNA種類與含量進行分析，發現Hsp16.3可抑制miR-181a與miR-146a，并促進已產生的miR-181a與miR-146a降解。從而直接參與MTB的免疫逃避過程。

2.2.3 Hsp16.3抑制TLR2表達及其正常作用 Haibo Su等[12]發現Rv2029c可通過TLR2介導的下游通路增加MHC-II的表達，進一步刺激CD4+T細胞活化與凋亡的形成。在MTB感染的巨噬細胞中，此通路可被Hsp16.3抑制，減少T細胞活化與凋亡的早期形成。

2.2.4 Hsp16.3促進LAG3過表達 此外，淋巴細胞活化基因3（LAG3）過表達時，CD4+T細胞介導的Th1細胞免疫應答顯著減少，并加劇MTB在細胞內繁殖。Hsp16.3參與介導了LAG3的過表達，且與LAG3對細胞內MTB繁殖有協同作用[11]。

3 Hsp16.3臨床應用前景

3.1 Hsp16.3相關分子早期檢測

TLR2/TLR12介導的下游通路可增加MHC-II的表達，進一步刺激CD4+T細胞活化與凋亡的形成，在MTB感染的巨噬細胞中，Hsp16.3表達增多，并可抑制TLR2，使TLR2表達處在較低水平。 Qing-Lin Meng等利用U937細胞系作為體外巨噬細胞模型，通過對MTB感染巨噬細胞中mRNA種類與含量進行分析，發現miR-93-3p在巨噬細胞感染后顯著下降，且在隱性感染模型中也可檢測到含量變化。以上結果提示，TLR2/TLR12，Caspase-3，Bcl-2，TNFα，miR-93-3p可作為早期MTB感染的檢測指標[13]。

3.2 靶向藥物開發

如前所述，Hsp16.3表達增多時，可抑制TLR2，使TLR2表達處在較低水平。增加TLR2表達可作為MTB治療靶點之一。劉紅艷等[14]發現miR-19b沉默可上調TLR2表達，進一步促進MTB誘導的大鼠肺泡巨噬細胞凋亡。此外，Yongyan Wu等[15]證實Sp110可與Hsp16.3結合，阻斷Hsp16.3與細胞內分子的結合，釋放凋亡相關分子，使凋亡過程回到正常水平。另一方面，Sp110可與核糖體蛋白Rps3a結合，上調前凋亡聚合酶(PARP)表達水平，進一步促感染細胞凋亡。 以上結果提示，TLR2，miR-19b，Sp110 可作為MTB治療靶點。

3.3 Hsp16.3疫苗研發

Geluk等發現，單獨注射卡介苗并不能增強T細胞針對Hsp16.3的免疫應答作用，使疫苗在針對部分靜止期胞內寄生MTB或隱形感染患者時大大減少[16]。C.Shi等發現，將Hsp16.3或其合成肽注入小鼠時，細胞免疫與體液免疫均較注射卡界面有所增強，且MTB增值有所減緩。實驗結果提示，將Hsp16.3或其合成肽設計成疫苗，可能會刺激機體產生更有效的免疫應答[17]。

4 展望

該研究進展通過對Hsp16.3介導MTB致巨噬細胞凋亡作用及其發生機制的相關文獻進行梳理，總結出 LC3，miR-181a、miR-146a，TLR2 與 LAG3 等 4 條可能的通路，并針對Hsp16.3提出早期分子檢測、靶向藥物開發、Hsp16.3疫苗研發等臨床應用意見，以期為臨床治療提供幫助指導。但上述凋亡相關通路還需進一步闡明詳細機制，Hsp16.3相關分子檢測技術、臨床用藥、新型疫苗還有待進一步臨床試驗。

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