內(nèi)皮抑素衍化30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖活性和遷移能力的影響

于佳琪 ，趙航 ，楊揚(yáng) ，魏欣鵬 ，牛淑冬 ，李淑艷

1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院2014級(jí)臨床專業(yè)，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院2015級(jí)臨床專業(yè)，黑龍江齊齊哈爾 161006；

3.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006；4.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江齊齊哈爾 161006

盡管在控制風(fēng)險(xiǎn)因素和監(jiān)測(cè)方面有所改善，肝細(xì)胞癌仍然是世界癌癥死亡的原因之一[1]，該病是臨床上常見的惡性腫瘤，造成肝癌患者死亡的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。外科手術(shù)、射頻消融RFA、介入治療等綜合治療的方案，目前仍舊無法取得理想的遠(yuǎn)期療效，有觀點(diǎn)認(rèn)為：生物治療在在該病治療中具有巨大的潛力[2]，而新型的蛋白質(zhì)多肽有望成為高效、低毒的抗肝癌藥物。

2005年，Robert M等[3]發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮抑素N末端鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域的27個(gè)氨基酸負(fù)責(zé)其抗腫瘤活性。2007年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)劉興漢教授課題組在對(duì)人類內(nèi)皮抑素基因進(jìn)行改造并人工合成、表達(dá)人內(nèi)皮抑素30肽，該多肽是將內(nèi)皮抑素25～31位RGIRGAD序列改為RGDRGD[4]。

該研究將人肝癌HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，研究30肽對(duì)其增殖和遷移能力的影響，為該多肽用于肝癌的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

HepG2細(xì)胞株為本課題組凍存，RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品、胎牛血清、胰酶均為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，基質(zhì)膠、Sephadex G-15 medium為sigma公司產(chǎn)品，WST-1試劑盒購(gòu)自羅氏 （瑞士）公司，幾丁質(zhì)親和層析樹脂購(gòu)自NEB公司，Transwell小室為Corning Costar公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 30肽的提取和純化 參考王淑靜的純化方法[5]，分別從構(gòu)建的30肽基因工程菌中提取純化30肽，經(jīng)葡聚糖凝膠G15層析去除DTT。通過Tricine-SDSPAGE鑒定其純度。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將肝癌HepG2細(xì)胞1×103個(gè)/孔加入96孔培養(yǎng)板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，各孔中分別加入濃度為 0、20、40、60、80 μg/mL 和 100 μg/mL 的 30肽，每個(gè)濃度5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后將孔板中培養(yǎng)基吸去，PBS沖洗后加入無血清培養(yǎng)基100 μL+10 μLWST-1，常規(guī)培養(yǎng)1 h，分別以450 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，630 nm為參考波長(zhǎng)用酶標(biāo)儀測(cè)定、記錄各孔吸光度值。

1.2.3 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響 通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)30肽對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響。參考Liu等[6]方法，以5 μg纖粘蛋白涂于Transwell小室聚碳酸酯膜外表面，置超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干，5 μg基質(zhì)膠涂于小室內(nèi)表面，干燥，形成基質(zhì)屏障層。用終濃度為50 μg/mL的30肽分別處理HepG2細(xì)胞0、12、24 h和48 h。用胰酶消化細(xì)胞，用無血清1640培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞濃度調(diào)整1×105個(gè)/mL，取細(xì)胞懸液100 μL加至Transwell小室中，在小室外培養(yǎng)板內(nèi)加入500 μL含20%血清的培養(yǎng)基，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后，吸棄小室中的培養(yǎng)基，用棉簽拭去小室內(nèi)側(cè)壁未轉(zhuǎn)膜的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色0.5 h，晾干，顯微鏡下進(jìn)行穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)，拍照保存，每膜計(jì)上下左右中5個(gè)不同視野的穿膜細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算平均值，每組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料（±s）進(jìn)行t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮抑素衍化30肽的表達(dá)及純化

重組30肽經(jīng)幾丁質(zhì)親和層析后，葡聚糖凝膠G15 除 DTT，分別取 5 μg 和 2 μg 進(jìn)行 Tricine-SDSPAGE小肽電泳，結(jié)果如圖1中所顯示，特異條帶分子量在3kDa左右出現(xiàn)，與目標(biāo)條帶分子量預(yù)期相符。

圖1 純化內(nèi)皮抑素衍化30肽的Tris-Tricine-SDS-PAGE鑒定[M.分子量 marker；A.30 肽（5 μg）；B.30 肽（2 μg）]

2.2 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

分別取濃度分別為 0，20，40，60，80，100 μg/mL的30肽作用HepG2細(xì)胞24 h和48 h，隨著劑量和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞的活性明顯被抑制，30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的抑制作用呈時(shí)間-劑量依賴性。應(yīng)用線性回歸分析計(jì)算出30肽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)半數(shù)抑制濃度為 49.7 μg/mL(IC50=49.7 μg/mL)。結(jié)果見圖2。

圖2 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用

2.3 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

用終濃度為50 μg/mL的30肽分別處理HepG2細(xì)胞0、12、24 h和48 h。 通過體外Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)30肽對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響，從圖3A可見，4組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別是（205.5±4.5）、（132.6±3.0）、（71.3±2.6）、（48.6±5.1），30 肽明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制遷移能力明顯增加（圖3B）。

圖3 30肽對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響[＊P＜0.05，與 30 肽 0 h 組比較]

3 討論

肝癌是全球癌癥相關(guān)死亡率最常見的原因之一，在中國(guó)尤其如此[7]，侵襲和轉(zhuǎn)移在該病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，也是腫瘤與正常細(xì)胞的主要區(qū)別,肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力是致使外科手術(shù)及放、化療等綜合治療手段療效差和該病死亡率、復(fù)發(fā)率高的最主要原因，此外腫瘤的生長(zhǎng)與血管生成等因素密切相關(guān)，尋找和開發(fā)有效、安全的阻斷抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和轉(zhuǎn)移的靶向藥物，一直是研究的熱點(diǎn)問題。

膠原蛋白XVIII由十個(gè)膠原結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，內(nèi)皮抑素位于第一非膠原結(jié)構(gòu)域區(qū)，由三聚結(jié)構(gòu)、內(nèi)皮素結(jié)構(gòu)域和鉸鏈區(qū)組成，其中鉸鏈區(qū)位于N-末端的三聚結(jié)構(gòu)和C-末端的內(nèi)皮抑素結(jié)構(gòu)域之間。1997年，O′Reilly等[1]證實(shí)內(nèi)皮素具有特異性地抑制血管內(nèi)皮增殖并有效地抑制血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的作用，分子量為20 kDa，是血管生成和腫瘤生長(zhǎng)的內(nèi)源性抑制劑將其命名為Endostatin，而在隨后的研究中證實(shí)，Endostatin是膠原蛋白XVIII的C-末端片段，其衍生肽與整聯(lián)蛋白相互作用并調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移并描述了在內(nèi)皮抑素內(nèi)具有整合素結(jié)合序列[8]，此外研究其發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、改善非纖維化等作用[9-10]，已作為一種抗腫瘤藥物用于臨床，但內(nèi)皮抑素分子量較大、有不良反應(yīng)是其臨床應(yīng)用中的不足之處和有待突破的瓶頸問題，如何在不影響其抑制腫瘤活性的前提下，嘗試減小其分子量、對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾是其對(duì)其研究的方向。

N-末端的27個(gè)氨基酸是內(nèi)皮抑素的活性區(qū)域，30肽是人工對(duì)27肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的產(chǎn)物，后者即有內(nèi)皮抑素的活性區(qū)，又具有有RGDRGD序列。串聯(lián)的RGD與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上αⅤβ3整合素結(jié)合，抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，還與大多數(shù)腫瘤細(xì)胞膜上α5β1整合素結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移[11]。

該實(shí)驗(yàn)采用了WST-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)活性，WST-1是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品，與MTT相比具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定、線性范圍更寬、靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn)，故實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加精確可信。實(shí)驗(yàn)中選擇了人肝癌HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，分別將20、40、60、80 μg/mL 和 100 μg/mL30 肽加入培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h和48 h后，可見HepG2細(xì)胞的增殖活性降低，其抑制作用與培養(yǎng)時(shí)間和30肽劑量增加而增強(qiáng)，即具有時(shí)間-劑量依賴性。統(tǒng)計(jì)分析計(jì)算結(jié)果顯示，30肽對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)半數(shù)抑制濃度為49.7 μg/mL。

通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)30肽對(duì)HepG2細(xì)胞遷移能力的影響，使用Matrigel等基質(zhì)成分模擬體內(nèi)基底膜，腫瘤細(xì)胞穿越Matrigel和聚碳酸酯膜也需要完成粘附、基質(zhì)降解及運(yùn)動(dòng)等多個(gè)環(huán)節(jié)[12]，用50 μg/mL 的 30 肽分別處理 HepG2 細(xì)胞 0、12、24 h和48 h后，4組細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)分別是 （205.5±4.5）、（132.6±3.0）、（71.3±2.6）、（48.6±5.1），結(jié)果可見，30肽明顯抑制HepG2細(xì)胞的遷移能力，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制細(xì)胞遷移的能力明顯增加。

綜上所述，RGD修飾的30肽不僅具有抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖活性，還對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移有抑制作用，從而產(chǎn)生腫瘤轉(zhuǎn)移能力下降效應(yīng)，但是，30肽發(fā)揮其抑制HepG2細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移行為的具體機(jī)制如何，今后我們課題研究的目標(biāo)。

[1]Torre LA,Bray F,Siegel RL,et al.Global cancer statistics,2012.[J].CA Cancer J Clin，2015，65(2):87-108.

[2]European Association For The Study Of The Liver,Euro pean Organisation For Research And Treatment Of Cancer.EASL-EORTC clinical practice guidelines:management of hepatocellular carcinoma[J].J Hepatol.2012,56(4):908-943.

[3]Robert M,Tjin Tham Sjin,1 Ronit Satchi-Fainaro,et al.A 27-amino-acid synthetic peptide corresponding to the NH2 terminal zinc-binding domain of endostatin is responsible for its antitumor activity[J].Cancer Res，2005，65(9):3656-3663.

[4]LIDan,LIU Xinghan,ZHAO Weiming,et al.Gene Cloning,Expression and Activ ity of Anti-Tumor Peptide of Human Endostatin[J].J MedMol Biol,2007,4(6):475-479.

[5]WANG Shu-Jing,LIU Xing-Han,JI Yu-Bin,et al.Study on Biological Activity of Two Modified Anti-tumor Peptide of Tumstatin[J].Progress in Biochemistry and Biophysics，2007，34(11):1152-1161.

[6]Hui-Kun Liu,Qi Wang,Yang Li，et al.Inhibitory effects of γ-tocotrienol on invasion and metastasis of human gastric adenocarcinoma SGC-7901 cells[J].Journal of Nutritional Biochemistry，2010，21(9):206-213.

[7]Qin A,Zhu J,Liu X，et al.MicroRNA-1271 inhibits cellular proliferation of hepatocellular carcinoma[J].Oncol Lett，2017，14(6):6783-6788.

[8]Sara A.Wickstrom,Kari Alitalo，Jorma Keski-Oja.An Endostatin-derived Peptide Interacts with Integrins and Regulates Actin Cytoskeleton and Migration of Endothelial Cells[J].J Biol Chem，2004，279(9):20178-20185.

[9]O′reillym S,Boehm T,Shing Y,et al1 Endostatin:An endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell,1997,88(2):277-285.

[10]Yun-Yan Wan,Guang-Yan Tian,Hai-Sheng Guo,et al.Endostatin, an angiogenesis inhibitor, ameliorates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats[J].Respir Res,2013,14:56-68.

[11]Jonathan Golledge,Paula Clancy,Graeme J,et al.Serum Endostatin concentrations Are Higher in Men with Symptoms of Intermittent Claudication[J].Dis Markers，2014,30:1-5.

[12]Erreni M,Siddiqui I,Marelli G,et al.The Fractalkine-Receptor Axis Improves Human Colorectal Cancer Prognosis by Limiting Tumor Metastatic Dissemination[J].J Immunol，2016,196(2):902-914.