程序性細胞死亡蛋白4在大鼠腦出血后血腫周圍域的表達及作用

沈加兵，季宇騰，周婷婷，曹茂盛，陳穎，曹茂紅，柯開富

(1.南通大學醫學院，南通226001；2.南通大學附屬醫院神經內科)

·基礎研究·

程序性細胞死亡蛋白4在大鼠腦出血后血腫周圍域的表達及作用

沈加兵1，季宇騰2，周婷婷2，曹茂盛2，陳穎2，曹茂紅2，柯開富2

(1.南通大學醫學院，南通226001；2.南通大學附屬醫院神經內科)

[摘要]目的探索程序性細胞死亡蛋白4(PDCD4)在腦出血(ICH)后血腫周圍域的表達、作用及機制，為ICH疾病的后期康復治療提供分子靶點。方法Western blot、免疫組織化學檢測蛋白質的表達變化；免疫熒光技術檢測蛋白質的空間定位情況；siRNA轉染進行細胞內蛋白質的干預。結果PDCD4在大鼠ICH后血腫周圍組織中表達上調，最高點位于ICH后第2天；上調的PDCD4主要與神經元NeuN存在共定位，并且與上調的凋亡蛋白活化Caspase-3之間也存在共定位；體外ICH模型中(即hemin誘導的神經元凋亡模型)，通過siRNA靶向干預PDCD4的表達，則活化caspase-3明顯降低，而存活因子p-Akt上調。結論ICH后血腫周圍域PDCD4的表達上調與神經元的凋亡相關，并且是通過p-Akt通路發揮作用的。

[關鍵詞]腦出血；血腫；程序性細胞死亡蛋白4；疾病模型，動物

腦出血(ICH)是中樞神經系統的急、重癥，具有極高的致死率和致殘率，給社會、家庭帶來了沉重的痛苦和負擔[1]。ICH的病理損傷主要表現為血腫周圍區域神經元的損傷，以及膠質細胞的增生、活化[2]。由于中樞神經系統神經元的死亡不可再生，因此探索ICH后血腫周圍區域神經元損傷的分子機制，對ICH疾病的治療具有極大的意義。

程序性細胞死亡蛋白4(PDCD4)，顧名思義為凋亡過程中上調的基因，廣泛分布于各類組織器官中。文獻報道PDCD4主要影響蛋白質的轉錄和翻譯，從而對基因表達進行調控[3]。研究證明PDCD4在癌組織中表達缺如或低表達，對癌細胞的侵襲、擴散具有促進作用，因此它又稱之為抑癌基因。目前已發現PDCD4在多種類型原發性腫瘤中低表達，如肺癌、肝癌、乳腺癌以及腦腫瘤等[4]。2016年，Zhen報道PDCD4 mRNA水平在非小細胞肺癌中下調，通過體外誘導PDCD4的表達能夠明顯抑制腫瘤細胞的生長、增殖和細胞周期的轉換，原理上是通過滅活PI3K/Akt信號通路實現的[5]。近年來，越來越多的研究揭示PDCD4不僅對腫瘤的發生發展起調節作用，它與細胞轉型、炎癥、凋亡、增殖以及自噬等方面關系也很密切。例如，在小鼠模型中，PDCD4的缺失能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的致死性炎性反應[6]；抑制高脂飲食誘導的肝脂質性損害[7]。此外，在糖尿病模型中，PDCD4的高表達能夠誘導胰島B細胞的凋亡[8]。也有學者們認為PDCD4的功能表達主要是維持增殖、分化和凋亡三者之間的動態平衡[9]。然而，PDCD4在ICH疾病中具有怎樣的作用，目前還不得而知。因此，本研究將主要探索PDCD4在大鼠ICH模型中的表達、作用以及潛在的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(江蘇省實驗動物質量合格證書編號：201701835)，240～260 g，SPF級，由南通大學實驗動物中心提供。所有實驗動物的護理及外科手術均遵照1996年頒布的國家研究委員會的倫理要求操作。

1.2 實驗分組 主要分成2組。假手術組：只插針未注射；ICH組：顱內注射自體血50 μL。

ICH模型取3、6、12 h，1、2、3、5、7d為時間點，每組各12只大鼠，共96只；假手術組12只大鼠，總計108只大鼠。

1.3 ICH模型 以復合麻醉劑(3 mL/kg)腹腔注射麻醉；大鼠腦立體定位儀定位尾狀核區域(以囟門為正中點，向前0.2 mm，向右旁開3.5 mm，進針深度5.5 mm)，回針0.5 mm，以10 μL/min的速度注入自體血50 μL，或放置空針作為假手術組。麻醉過后，ICH組所有的大鼠表現左側肢體功能的癱瘓(旋轉或者向左側倒去)，證實ICH模型制作成功。

1.4 神經功能缺陷評分 前肢放置試驗和輪轉試驗主要參照之前發表的方法[10-11]。

1.5 Western blot 取新鮮腦組織冰上裂解，充分勻漿后，蛋白樣品定量。根據目的蛋白大小進行凝膠電泳。將轉好的膜放入5%脫脂奶粉封閉。封閉結束，孵育相應的一抗(山羊抗PDCD4抗體購買于Santa Cruz公司，其他抗體均購置于Cell Signaling Technology)，4 ℃過夜。孵育二抗，翻板室溫翻轉1 h后，ECL顯影。

1.6 免疫組織化學 ICH后2天的大鼠以4%多聚甲醛灌注、取腦，浸泡12 h后，20%、30%蔗糖梯度脫水。進行冰凍切片，厚度12 μm，室溫保存。

免疫組織化學主要運用免疫組織化學試劑盒(購于Abcam公司)，按照說明書順序進行，加入PDCD4孵育12 h；免疫熒光：取切片水化，0.5% Triton x-100通透細胞膜，0.1% BSA(胎牛血清)封閉后加入PDCD4、NeuN、GFAP及IBA1抗體，4 ℃孵育過夜，加入相應的二抗，熒光顯微鏡下拍照(德國萊卡)。

1.7 細胞培養與轉染 孕18 d大鼠，乙醚麻醉后提取原代皮層神經元，培養在Neurobasal添加B27 supplement培養基中(購于Gibco公司)，每3天換液1次，培養至5 d時以100 μM hemin刺激細胞，在不同時間點收細胞。進行轉染siRNA時，PDCD4 siRNA和Control siRNA運用脂質體法(lipofectamine 2000)(均由Invetrogen提供)轉染進入細胞內。轉染的細胞培養30 h后，hemin刺激進行收細胞檢測。

2 結果

2.1 PDCD4在大鼠ICH后血腫周圍組織中的表達情況 神經功能缺陷評分參照之前的研究[10-11]。圖1A和圖1B顯示PDCD4蛋白水平在ICH后血腫周圍組織中表達上調，隨時間點增高呈現單峰趨勢，最高點位于ICH后第2天。運用免疫組織化學的方法，本研究進一步驗證了PDCD4的表達情況。從圖1C～圖1I中，可以觀測到PDCD4主要在ICH后血腫周圍區域表達增高，而血腫對側腦域表達上調情況不明顯。

2.2 PDCD4在大鼠ICH后血腫周圍域的定位 ICH后血腫周圍域細胞環境非常復雜，為進一步探索PDCD4在其間的作用，本研究選用免疫熒光技術檢測PDCD4與哪類神經細胞相關聯。圖2免疫熒光雙標技術分別檢測PDCD4與神經元(NeuN)、星形膠質細胞(GFAP)以及小膠質細胞(Iba1)的共定位情況。結果顯示上調的PDCD4主要定位于神經元。

注：PDCD4為程序性細胞死亡蛋白4；a與Sham相比，差異有統計學意義(P<0.05)

圖1腦出血后血腫周圍域PDCD4的表達情況A為western blot檢測PDCD4的蛋白水平；B為A的條形統計圖；C、F為假手術(Sham)的對應區域PDCD4表達情況；D、G為ICH后2天血腫對側區域PDCD4的表達情況；E、H為ICH后2天血腫同側區域PDCD4的表達情況；I為C～H的統計圖

注：PDCD4為程序性細胞死亡蛋白4

2.3 PDCD4與大鼠ICH后血腫周圍域神經元凋亡的關系 ICH后神經功能的損傷主要表現為神經元的死亡，那么上調的PDCD4是否與神經元的凋亡相關。由此，本組檢測了血腫周圍域凋亡蛋白活化caspase-3的表達，以及促存活因子Akt的磷酸化情況。圖3A～圖3D結果顯示活化caspase-3在ICH后第2天表達最高，而p-Akt在第2天表達最低。圖3E免疫熒光技術檢測顯示活化caspase-3主要與神經元、PDCD4共定位，由此進一步證實了本組的猜想，上調的PDCD4可能與ICH后血腫周圍域神經元的凋亡相關。

2.4 PDCD4在體外ICH模型中的表達 為進一步證實上調的PDCD4與神經元的凋亡存在相關性，本組構建了體外ICH模型，即血紅素Hemin誘導的神經元凋亡模型。在此基礎上，本研究檢測了PDCD4的表達，以及活化caspase-3的表達。圖4A和圖4B顯示PDCD4、活化caspase-3在hemin誘導的神經元凋亡模型中表達上調，并隨時間逐漸增加，12 h后達最高峰。同樣，圖4C和圖4D檢測了p-Akt的表達情況，結果顯示p-Akt隨時間逐漸下降，于12 h達最低谷。與體內表達是一致的，由此證明血紅素誘導的神經元凋亡模型(體外ICH模型)是成功的。

2.5 PDCD4在體外ICH模型中的作用 為證實PDCD4與神經元凋亡之間的因果聯系。本組轉染了PDCD4的特異性siRNA，圖5A和圖5B顯示在Hemin刺激條件下，PDCD4 siRNA組PDCD4的表達明顯低于Non-specific siRNA組。在此條件下，Active caspase-3表達減少，而p-Akt水平則增高。這些結果說明了PDCD4可以促進神經元的凋亡，并且可能通過p-Akt途徑發揮作用的。

3 討論

本研究發現PDCD4在ICH后血腫周圍區域表達增高，并且在空間表型上主要與神經元存在共定位關系，與星形膠質細胞、小膠質細胞無共定位情況。因為ICH后神經元的凋亡/死亡是ICH疾病的最嚴重后果，由此本研究進一步檢測了PDCD4的上調與神經元凋亡的關系。本研究發現ICH條件下，PDCD4與血腫周圍域神經元、Active caspase-3之間存在時間、空間上的相關性，并且與p-Akt之間也存在一定關聯。為明確PDCD4與神經元凋亡之間的因果聯系，本組構建體外ICH模型，即Hemin誘導的神經元凋亡模型，運用PDCD4的特異性siRNA干預PDCD4的表達，來明確Active caspase-3、p-Akt的表達情況，結果顯示PDCD4干預后，Active caspase-3隨之下調，而p-Akt則上調。綜上，本研究證實了在ICH條件下，PDCD4的上調與血腫周圍域神經元的凋亡相關，并且是通過抑制Akt的磷酸化，抑制其促存活作用來發揮效應的。

注：PDCD4為程序性細胞死亡蛋白4；a與Sham組相比，P<0.05

注：PDCD4為程序性細胞死亡蛋白4；a與Control組相比，P<0.05

注：PDCD4為程序性細胞死亡蛋白4；a與Non-specific siRNA組相比，P<0.05

PDCD4，腫瘤抑制基因，能夠結合到真核生物翻譯起始因子4A1上，從而阻斷RNA的結合發揮抑制蛋白質的翻譯作用，因此其表達降低主要與腫瘤的增殖有關[12]。然而，越來越多的研究開始關注其在非腫瘤中的作用[13-14]。PDCD4發揮不同的作用可能與其所處的細胞環境相關。本研究證實，PDCD4在ICH后血腫周圍域組織中上調，可能與促神經元凋亡相關。

PI3K/Akt通路是神經元存活過程中一條重要信號途徑。PI3K的激活能夠通過第二信使導致Akt從細胞質向細胞膜遷移，同時Akt活化，活化的Akt磷酸化促凋亡因子Bad，從而阻止了Bad與Bcl-2或Bcl-xl的結合，發揮促存活作用[15]。另外，激活的Akt還能夠抑制caspase-9的活性，通過阻斷Caspase級聯反應，發揮保護作用[16]。本研究體外ICH模型中，通過siRNA干預PDCD4的表達，p-Akt水平則明顯上調，由此證明PDCD4能夠通過抑制Akt的磷酸化，從而發揮促凋亡作用。

PDCD4在ICH后血腫周圍域發揮促神經元凋亡的作用，并且是通過下調p-Akt通路實現的。

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ExpressionandroleofPDCD4intheareaadjacenttohematomaafterintracerebralhemorrhage

ShenJiabing*,JiYuteng,ZhouTingting,CaoMaosheng,ChenYing,CaoMaohong,KeKaifu

(*MedicalSchoolofNantongUniversity,Nantong226001,China)

Corresponding author:KeKaifu,Email:kekaifu_nt@126.com

[Abstract]ObjectiveTo explore the expression,role and potential mechanism of PDCD4 in area adjacent to hematoma after intracerebral hemorrhage (ICH),and provide a molecular target for the treatment and neuronal recovery of ICH in future.MethodsProtein levels were examined by western blot and immunohistochemistry;the spatial location for proteins was detected by immunofluorescence;siRNA transfection was used to intervene in the protein in the cells.ResultsPDCD4 expression was up-regulated in the area adjacent to hematoma after ICH,and the peak of the level for PDCD4 was reached in the second day after ICH;the up-regulated d PDCD4 expression had a co-localization with NeuN,and it also had a co-localization with neuronal apoptotic protein,activated caspase-3;in the ICH model in vitro,neuronal apoptotic model induced by hemin,the expression of activated caspase-3 was decreased,and the expression of the survival factors p-Akt was increased,by intervening in the expression of PDCD4 with siRNA.ConclusionThe up-regulation of PDCD4 expression in the area adjacent to hematoma after ICH is associated with neuronal apoptosis,which might be relevant to p-Akt signaling pathway.

[Keywords]Cerebral hemorrhage；Hematoma；Programmed cell death 4；Disease models，animals

中圖分類號：R743.34

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2018.03.025

基金項目：國家自然科學基金資助(81671135)；江蘇省學術學位研究生科研創新計劃項目資助(KYZZ16_0356)；南通大學研究生科技創新項目資助(YKC16058)

作者簡介：沈加兵，博士在讀，Email：shen_jia_bing@126.com

通信作者：柯開富，主任醫師，教授，博士生導師，Email：kekaifu_nt@126.com

2017-12-21)