法舒地爾對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠炎癥反應的影響

劉煥龍 陳雪彥 楊秀嶺 尹憲秋 張志清

(河北醫科大學第二醫院藥學部，河北 石家莊 050000)

肺動脈高壓(PAH)是一種致殘率和病死率均很高的臨床綜合征，呈進行性加重，以肺血管阻力升高為特征，與血管收縮、管壁重塑及原位血栓形成三種因素的綜合作用有關，但確切發病機制尚未明確。免疫炎癥因素在多種類型PAH形成及血管重塑過程中起著關鍵性作用，有學者提出〔1〕肺部炎癥細胞浸潤及炎癥破壞，是無缺氧時肺血管重建和血流動力學指標改變的重要因素，另外缺氧時期炎癥因子可進一步介導和調控肺血管構型重建，炎癥治療可能成為未來PAH治療的一個新的方向〔2〕。但免疫炎癥反應參與肺動脈重構的確切機制仍需進一步闡明。研究發現Rho/ROCK信號通路可能參與多種原因引起的PAH形成過程〔3〕，此通路的異常活躍也促進了炎癥反應的發生，誘導炎性細胞骨架蛋白的運動，在炎癥的多個環節都發揮重要作用，包括炎癥細胞的遷移、趨化及浸潤〔4〕。Rho激酶抑制劑法舒地爾通過阻斷肌球蛋白輕鏈(MLC) 磷酸化，抑制血管平滑肌的收縮，舒張血管，降低血管阻力。隨著Rho/ROCK信號轉導通路在PAH機制中的研究深入，該藥可能成為預防和治療PAH新的選擇藥物之一，但其具體作用機制還有待進一步闡明。本文探討法舒地爾對野百合堿(MCT)誘導的PAH大鼠的炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1動物、藥品與試劑、儀器 清潔級雄性SD大鼠30只，體重180～200 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供，合格證編號：1503015。MCT購自美國Sigma公司；鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業股份有限公司，生產批號：1401101；大鼠白細胞介素(IL)-6、TNF-α和MCP-1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。BL-420F生物信號分析系統購自成都泰盟科技有限公司；DM2500病理圖像分析系統購自德國萊卡；Floustar多功能微板分析儀購自德國BMG公司。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組及處理 30只大鼠隨機分為對照組，模型組，法舒地爾組，每組10只。模型組和法舒地爾組分別一次性皮下注射MCT 60 mg/kg，4 w可形成PAH。對照組皮下注射等量生理鹽水。法舒地爾組自注射MCT之后1 w起以法舒地爾(15 mg/kg)腹腔注射，每日1次。對照組和模型組給予等量生理鹽水。3 w后達到實驗終點，進行各項指標的測定。

1.2.2血流動力學指標的測定 參照文獻〔5〕方法測定肺動脈壓(PAP)和體循環壓(SAP)。右心導管預充肝素生理鹽水后與三通管相連，再經生物換能器與生理記錄儀相連。大鼠稱重，腹腔注射3%的戊巴比妥鈉麻醉，頸部消毒后于正中偏右縱向切開皮膚，分離并暴露出右頸外靜脈，并在其下穿入兩根手術線備用，其中的一根線結扎血管遠心端，然后用眼科剪一切口，沿此切口向心臟準確地插入導管，輕輕向前推進導管，參考生理記錄儀上所顯示的壓力波形及壓力值來判斷導管口所到達的位置并做好記錄，當出現典型的肺動脈壓力波形時固定導管，記錄PAP。同時，分離左側頸總動脈，插管并檢測SAP。

1.2.3右心肥厚指數(RVHI)測定 參考相關文獻〔6〕，血流動力學指標測定結束后，取下大鼠心臟，剪去心房及大血管根部，沿后室壁間溝將心臟分離成右心室(RV)和左心室加室間隔(LV+S)兩部分，吸干心肌表面水份，精確稱量RV和LV+S兩部分的重量。RVHI=〔RV/(LV + S)〕×100%。

1.2.4IL-6、TNF-α和MCP-1含量測定 上述血流動力學指標測定結束后，腹主動脈取血，靜置后離心，取上層血清分裝后，-70℃冷凍備用。ELISA試劑盒測定炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量，具體參照試劑盒說明書操作。

1.2.5肺組織取材及病理檢查 取出大鼠左側肺葉，置于10%的甲醛中固定3～5 d，進行石蠟包埋并切片，進行HE 染色。顯微鏡觀察肺組織形態學變化，分析炎性細胞的浸潤情況。同時利用圖像分析系統測定直徑小于200 μm的肺小動脈管壁厚度(WT)、肺小動脈外徑(ED)、管腔面積(VA)和血管總面積(TVA)，從每只大鼠中選取一張肺組織切片，每張切片連續觀察10條直徑<200 μm的肺小動脈，分析并測定上述指標。然后分別計算管壁厚度與血管外徑比值(WT%)、管腔面積與血管總面積比值(VA%)，WT%=WT/ED×100%，VA%=VA/TVA×100%。

1.3統計學方法 采用Adobe photoshop CS進行圖像處理，SPSS15.0、Origin7.5軟件進行單因素方差分析，Dunnet-t檢驗。

2 結 果

2.1各組一般狀況及死亡情況 對照組大鼠皮毛順滑，動作敏捷，飲食正常。模型組大鼠體力虛弱，反應較為遲鈍，大多蜷縮少動，皮毛暗淡無光澤，出現呼吸困難癥狀。法舒地爾組治療1 w后活動量較模型組增加，呼吸困難癥狀緩解。實驗動物死亡情況：本實驗共死亡5只大鼠，模型組3只大鼠分別死于實驗第15，18和24天，治療組2只死亡，分別死于第18和24天，大鼠死亡前均表現為呼吸困難、口鼻發紺。

2.2各組體重變化 對照組大鼠體重穩步增長，與第1天相比，第10～28天體重均明顯增加(P<0.01)，模型組大鼠在注射MCT后體重無明顯增加，法舒地爾組大鼠體重在第20～28體重明顯增加(P<0.01)。見表1。

2.3各組血流動力學指標及RVHI變化 與對照組相比，模型組PAP和RVHI均明顯升高(P<0.01)，而法舒地爾組PAP和RVHI均較模型組明顯降低(P<0.05)。各組SAP差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4各組炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1水平比較 與對照組相比，模型組血清炎性因子IL-6、TNF-α和MCP-1含量均顯著升高(P<0.01)。而法舒地爾治療組不同程度降低了上述炎性因子的表達(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表1 各組體重變化

與本組內第1天比較：1)P<0.01

表2 各組血流動力學指標及RVHI變化

與對照組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.05

表3 各組炎性因子水平比較

與對照組比較：1)P<0.01，與模型組比較：2)P<0.05,3)P<0.01

2.5各組光鏡下肺組織炎性情況觀察 對照組肺組織中炎性細胞數相對較少；模型組肺組織及肺小血管周圍出現大面積炎性細胞浸潤，有淋巴細胞及少量單核細胞和中性粒細胞聚集；而法舒地爾組肺組織中可見各類炎性細胞浸潤現象明顯減輕。見圖1。

圖1 各組肺組織炎性情況觀察(HE，×100)

2.6各組光鏡下肺小動脈形態學觀察和構型重建分析 肺組織HE染色結果顯示：對照組大鼠肺小血管內表面光滑，內皮細胞連續排列，細胞均勻分布，肺小動脈管壁較薄，管腔較大；而模型組大鼠肺小動脈內皮細胞破壞嚴重，呈現斷續排列，并呈突向血管腔內，管壁厚度顯著增加，管腔面積明顯變小；法舒地爾組大鼠肺小動脈內皮細胞連續性有所好轉，管壁厚度較模型組明顯縮小，管腔面積明顯擴大，見圖2。與對照組相比，模型組大鼠肺小動脈WT%明顯增加(P<0.01)，而VA%顯著降低(P<0.01)，說明出現了明顯肺血管構型重建；而法舒地爾干預后肺小動脈WT%明顯下降(P<0.05)，VA%顯著增加(P<0.01)，說明法舒地爾明顯抑制了肺血管構型重建。

圖2 各組肺組織病理學觀察(HE，×100)

3 討 論

本實驗結果與文獻報道〔7〕的結果一致，證實MCT能夠作用于肺動脈系統，誘導肺小動脈內皮損傷，引起炎性細胞浸潤，平滑肌細胞增殖、肥大等一系列病理改變，形成“炎癥性” PAH。

Rho激酶通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化導致肺動脈平滑肌收縮，其過度激活可造成肺血管強烈收縮，因此，Rho激酶異常活化是PAH發生的重要因素之一〔8〕。新興PAH研究靶點通過抑制Rho激酶途徑發揮舒張肺血管的作用而有益于PAH的治療，但具體機制可能遠非如此，也就是說，抑制Rho激酶后還可能會通過發揮其他方面的作用而益于PAH的治療。新型異喹啉磺胺衍生物法舒地爾，通過抑制Rho激酶活性阻斷肌球蛋白輕鏈磷酸化，起到舒張血管，降低血管阻力的作用，目前廣泛用于改善及預防蛛網膜下腔出血術后的腦血管痙攣及腦缺血癥狀。隨著Rho/ROCK信號通路在PAH發生發展中的研究深入，該藥有望成為預防和治療PAH的選擇藥物之一。本研究顯示法舒地爾能明顯降低PAH大鼠平均PAP 和RVHI，而SAP無明顯變化，與此相一致，Fujita 等〔9〕進行的小樣本臨床研究還表明法舒地爾能降低平均PAP以及肺血管阻力，說明法舒地爾在降低PAH患者肺血管阻力的同時不明顯影響體循環狀況，安全性較好，同時也說明其作用可能也不僅限于血管擴張作用。

鑒于炎癥參與肺血管重構，在PAH形成中起關鍵作用，而Rho/ROCK通路的異常活躍也促進了炎癥反應的發生，在炎癥的多個環節都發揮重要作用〔10〕，故

有理由推測Rho/ROCK通路可能參與了PAH發生發展過程中的炎性改變。而作為Rho激酶抑制劑的法舒地爾也可能會發揮一定的抗炎作用，而這必將有益于PAH的治療，也為該藥的臨床新用途提供基礎試驗資料。本研究顯示，模型組炎性因子含量均明顯增高，而法舒地爾明顯降低上述炎性因子表達，且能明顯抑制PAH大鼠的炎癥反應，而這可能與其改善MCT誘導的PAH損傷有關。

目前認為，PAH形成的關鍵在于肺血管重構，因此如何阻止及逆轉肺血管重構是治療PAH的關鍵環節〔11〕。本研究顯示，法舒地爾能明顯抑制MCT誘導PAH大鼠炎癥反應的發生，這可能是其改善PAH大鼠肺血管重建的重要機制。

4 參考文獻

1Joppa P,Petrasova D,Stancak B,etal.Systemic inflammation in patients with COPD and pulmonary hypertension〔J〕.Chest,2006;130:326-33.

2Price LC,Wort SJ,Perros F,etal.Inflammation in pulmonary arterial hypertension〔J〕.Chest,2012;141:210-21.

3Guilluy C,Eddahibi S,Agard C,etal.RhoA and Rho kinase activation in human pulmonary hypertension:role of 5-HT signaling〔J〕.Am J Res Crit Care Med,2009;179(12):1151-8.

4Schaafsma D,Gosens R,Zaagsma J,etal.Rho kinase inhibitors:a novel therapeutical intervention in asthma〔J〕?Eur J Pharmacol,2008;585(2-3):398-406.

5章新華，陳 磊，王懷良，等.大鼠肺動脈壓檢測方法研究〔J〕.中國醫科大學學報，2004；33(5)：388-9.

6吳蘇玲，畢立清，孔 輝，等.魯斯可皂苷元對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠炎癥反應的影響〔J〕.中國藥理學通報，2013;29(6)：823-7.

7Tofovic SP,Salah EM,Mady HH,etal.Estradiol metabolites attenuate monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2005;46(4):430-7.

8Fukumoto Y.Role of the Rho-kinase pathway in pulmonary arterial hypertension〔J〕.Nihon Yakurigaku Zasshi,2014;143(4):178-81.

9Fujita H,Fukumoto Y,Saji K,etal.Acute vasodilator effects of inhaled fasudil,a specific Rho-kinase inhibitor，in patients with pulmonary arterial hypertension〔J〕.Heart Vessels,2010;25(2):144-9.

10Nozaki Y,Kinoshita K,Hino S,etal.Signaling Rho-kinase mediates inflammation and apoptosis in T cells and renal tubules in cisplatin nephrotoxicity〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol,2015;308(8):F899-909.

11Lee SH,Rubin LJ.Current treatment strategies for pulmonary arterial hypertension〔J〕.J Intern Med,2005;258(3):199-215.