慢病毒介導siRNA干擾尿路上皮癌相關基因1表達對人肺腺癌細胞系A549惡性行為的影響

孫 莉 郭 穎 楊紅蘭

(勝利石油管理局勝利醫(yī)院腫瘤科，山東 東營 257055)

肺腺癌是非小細胞肺癌(NSCLC)的主要病理類型，占全部肺癌的50%以上〔1〕。絕大多數(shù)肺腺癌患者為周圍型肺癌，早期癥狀輕，影像學特征不明顯，且較易發(fā)生早期轉移〔2,3〕。研究顯示，尿路上皮癌相關基因(UCA)1參與包括膀胱癌、乳腺癌及結直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔4〕，但其對肺腺癌細胞惡性行為的影響及相關機制尚不明確。本研究通過慢病毒體外介導靶向UCA1的小干擾RNA(siRNA)下調(diào)人肺腺癌細胞系A549中UCA1的表達，探究其對細胞增殖轉移能力及上皮間充質轉化(EMT)進程的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 實驗細胞：包括人肺腺癌細胞系A549、H358、H1299、H460、人支氣管上皮細胞系HBE及人腎上皮細胞系HEK293T(美國ATCC)。實驗儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo，3111)、超凈工作臺(美國Thermo，Heraguard ECO 1.2)、低溫高速離心機(德國Sigma，3-18K)、PCR基因擴增儀(美國Bio-Rad，S1000)、超微量分光光度計(美國Thermo，SMA2000)、實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems，7500)、酶標儀(北京普天，PT-3502)、光學顯微鏡(德國Leica，DM1000)、電泳儀、轉膜儀及ChemiDoc XRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。實驗材料：DMEM及RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone)、轉染脂質體Lipofectamine 3000(美國Thermo)、慢病毒包裝載體(pLP1,pLP2,pLP VSV-G，美國addgene)及慢病毒目的載體(pDECKO-UCA1,pDECKO-blank、美國addgene)、嘌呤霉素(美國Sigma)、RNA提取試劑、逆轉錄試劑盒及Sybr Green熒光染料(日本Takara)、MTS試劑盒(美國Promega)、基質膠(美國BD Biosciences)、IP裂解液及蛋白酶抑制劑(上海生工)、E-鈣黏蛋白(cadherin)抗體(美國Sigma，SAB4503751)、波形蛋白(Vimentin)(美國Sigma，SAB4503083)、GAPDH(美國Sigma，G9545)、羊抗兔IgG(美國Sigma，RC05011A)、電化學發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒(美國Thermo)。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉染 人肺腺癌細胞系及人支氣管上皮細胞系均使用RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，人腎上皮細胞系使用DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清，培養(yǎng)于37℃，5%CO2生化培養(yǎng)箱中，超凈工作臺中進行嚴格無菌操作。慢病毒轉染構建干擾組及對照組細胞：接種HEK293T細胞于六孔板中，取2支1.5 ml離心管加入1 ml DMEM培養(yǎng)基，均加入1.00 μg pLP1、0.50 μg pLP2、0.75 μg pLP VSV-G各病毒包裝載體，分別加入2 μg pDECKO-UCA1載體及pDECKO-blank載體，室溫靜置10 min，均加入10 μl 轉染脂質體，混勻后靜置30 min，滴加入對數(shù)生長期的A549細胞中，保證培養(yǎng)基總體積為2 ml，4 h后更換DMEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)48 h，收集細胞上清液(病毒懸液)并過濾，1∶1與RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清混合培養(yǎng)A549細胞3 d，1 μg/ml嘌呤霉素篩選細胞7 d，完成干擾組及對照組細胞系的構建。

1.2.2RT-PCR檢測細胞中UCA1的表達 收集1×105個干擾組及對照組細胞，以及人肺腺癌細胞系及人支氣管上皮細胞系，1 ml RNA提取試劑重懸，進行細胞總RNA的抽提，超微量紫外分光光度計檢測總RNA的含量，1 μg 總RNA進行逆轉錄，得到的cDNA模板用DEPC水稀釋至500 μl，引物稀釋至20 nmol/μl，相關序列如下：UCA1上游引物：5′-CTCTCCATTGGGTTCACCATTC-3′，下游引物5′-GCGGCAGGTCTTAAGAGATGAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GCCAAAAGGGTCATCATCTC-3′，下游引物5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTC-3′，按10 μl Sybr Green熒光染料體系上樣，設置3個重復孔，ABI 7500系統(tǒng)分析每個上樣孔的熒光強度，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-△△CT法計算UCA1的相對表達量。

1.2.3MTS實驗檢測兩組細胞增殖能力 將干擾組及對照組細胞以1×104個/孔接種至96孔板中，設置3個重復孔，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。在0、12、24、48及72 h將MTS試劑與RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清培養(yǎng)基1∶5混合均勻，替換原有培養(yǎng)基，生化培養(yǎng)箱中靜置1 h，酶標儀檢測樣本490 nm處吸光度，兩組細胞各時間點的吸光度與0 h的吸光度的比值作為衡量細胞相關增殖能力的依據(jù)。

1.2.4Transwell侵襲及遷移實驗檢測兩組細胞侵襲遷移能力 稀釋基質膠至50 mg/L，將Transwell小室置于24孔板中，取100 μl 基質膠加入Transwell小室膜中央，生化培養(yǎng)箱中放置6 h，無血清RPMI1640培養(yǎng)基水化基底膜30 min，無血清RPMI1640重懸干擾組及對照組細胞，細胞計數(shù)后調(diào)整細胞懸液濃度至5×105/ml，取200 μl(細胞數(shù)為1×105個)加至上小室，下小室加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h作為Transwell侵襲實驗模型；另取未加入基質膠的Transwell小室置于24孔板中，同樣加入200 μl上述細胞懸液，下小室加入500 μl RPMI1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清，作為Transwell遷移實驗模型。無水乙醇固定細胞10 min，0.1%結晶紫染色30 min，棉簽拭去上室面細胞，PBS洗上室面3次，100倍光鏡下細胞計數(shù)，隨機取中間和四周5個視野，計算平均值及標準差。

1.2.5Western印跡實驗檢測兩組細胞E-cadherin及Vimentin的表達 收集1×106個干擾組及對照組細胞，500 μl IP裂解液+蛋白酶抑制劑重懸細胞，4℃裂解細胞1 h，4℃離心細胞10 min，取細胞上清液BCA法檢測總蛋白濃度，配置30 μg上樣體系，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白100 V轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，1∶500 E-cadherin抗體(135 kD)、Vimentin抗體(60 kD)、GAPDH抗體(37 kD)室溫孵育相應蛋白條帶2 h，1∶2 000二抗室溫孵育1 h，ECL發(fā)光液曝光顯影，掃描條帶灰度值，將E-cadherin及Vimentin與相應GAPDH的比值作為衡量E-cadherin及Vimentin表達的依據(jù)。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件，兩組計量資料比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組計量資料比較采用方差分析，SNK-q檢驗進行兩兩比較。

2 結 果

2.1肺腺癌細胞系與支氣管上皮細胞系UCA1表達的比較 A549、H358、H1299、H460中UCA1的表達量分別為(0.279±0.024)、(0.146±0.017)、(0.185±0.011)、(0.216±0.025)，均顯著高于HBE中UCA1的表達量(0.082±0.009)，差異具有統(tǒng)計學意義(F=16.330，P<0.01，兩兩比較：A549與HBE相比，q=13.827，P<0.01；H358與HBE相比，q=3.601，P<0.05；H1299與HBE相比，q=6.653，P<0.01；H460與HBE相比，q=8.143，P<0.01)。

2.2兩組細胞UCA1表達的比較 干擾組UCA1的表達量(0.065±0.008)顯著低于對照組(0.263±0.028，t=9.171，P<0.01)，干擾效率為73.2%。

2.3兩組細胞增殖能力的比較 干擾組48及72 h細胞增殖能力顯著低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組細胞各時間增殖能力的比較

2.4兩組細胞E-cadherin及Vimentin表達的比較 干擾組細胞E-cadherin相對表達量為(0.630±0.113)，顯著高于對照組細胞(0.371±0.086，t=3.159，P<0.01)；干擾組細胞Vimentin相對表達量為(0.124±0.036)，顯著低于對照組細胞(0.295±0.061，t=4.217，P<0.01)，見圖1。

圖1 兩組細胞E-cadherin及Vimentin表達的比較

2.5兩組細胞侵襲及遷移能力比較 干擾組侵襲細胞數(shù)為(59.3±7.9)，顯著少于對照組細胞數(shù)(92.8±10.2；t=3.681，P<0.01)；干擾組遷移細胞數(shù)為(64.6±8.5)，顯著少于對照組細胞數(shù)(107.3±13.0；t=4.720，P<0.01)，見圖2。

圖2 兩組細胞侵襲及遷移能力的比較(×100)

3 討 論

UCA1屬于長鏈非編碼RNA中的一員，不編碼相應蛋白，但卻通過表觀遺傳及轉錄修飾等機制調(diào)控機體的生長發(fā)育〔5〕。近年有研究顯示，UCA1不僅高表達于哺乳動物的胚胎組織中，且在多種惡性腫瘤中表達重新上調(diào)，并影響腫瘤細胞的惡性行為：①膀胱癌：Wang等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)UCA1在膀胱癌組織及胚胎組織中表達顯著上調(diào)，且可在體外促進細胞增殖及侵襲能力；Fan等〔7〕的研究顯示UCA1可通過介導Wnt信號通路促進膀胱癌細胞對順鉑的化療抵抗；Xue等〔8〕對UCA1促膀胱癌增殖轉移的機制進行了探究，發(fā)現(xiàn)UCA1可通過激活has-miR-145-ZEB1/2-FSCN1通路發(fā)揮促癌作用。②乳腺癌：Tuo等〔9〕在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)UCA1表達相比正常乳腺組織顯著上調(diào)，并確定其可通過調(diào)控微小RNA-143(miR-143)的表達，促進細胞增殖并抑制凋亡的生物學作用；Liu等〔10〕的研究證實了UCA1對乳腺癌細胞他莫昔芬耐藥的促進作用。③結直腸癌：Han等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)在結直腸癌組織中UCA1表達上調(diào)，且可通過促進細胞周期進程及抑制細胞凋亡導致腫瘤細胞的生長；Bian等〔12〕發(fā)現(xiàn)UCA1不僅可促進結直腸癌細胞的增殖，且可通過抑制miR-204-5p的表達，介導結直腸癌細胞5-氟尿嘧啶抵抗的發(fā)生。④胃癌：Shang等〔13〕在胃癌組織中同樣發(fā)現(xiàn)UCA1的高表達，通過siRNA下調(diào)胃癌細胞UCA1的表達后，細胞增殖及表阿霉素抵抗能力均顯著下降。⑤肝細胞癌：Wang等〔14〕同樣在肝細胞癌組織中檢測到UCA1表達上調(diào)，且UCA1的表達與患者TNM分期及轉移、復發(fā)密切相關，體外UCA1可促進肝癌細胞的成纖維細胞生長因子受體(FGFR)1的表達，進而介導細胞惡性行為的發(fā)生。⑥肺癌：Wang等〔15〕在非小細胞肺癌患者腫瘤組織及血清中發(fā)現(xiàn)UCA1的相對高表達，且其表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移密切相關；Nie等〔16〕體外干擾肺癌細胞UCA1表達后發(fā)現(xiàn)細胞增殖能力顯著下調(diào)。上述研究均提示，UCA1在多種惡性腫瘤中發(fā)揮著重要的促癌作用，但目前關于UCA1對肺腺癌細胞增殖轉移能力的影響及機制尚不明確。本研究通過慢病毒介導siRNA干擾肺腺癌細胞UCA1的表達后，觀察細胞增殖轉移能力的變化，明確了UCA1對肺腺癌細胞惡性行為的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，UCA1在不同的肺腺癌細胞系中表達均顯著上調(diào)，提示其可能參與促進正常支氣管細胞惡性轉化導致肺腺癌的發(fā)生過程。本文選擇UCA1高表達的A549細胞系構建了慢病毒介導的siRNA體外干擾模型，發(fā)現(xiàn)干擾UCA1的表達后，A549細胞增殖及侵襲遷移能力均顯著下調(diào)，從反面證實了UCA1對肺腺癌細胞惡性行為的促進作用。EMT是上皮來源惡性腫瘤的標志性特征，E-cadherin及Vimentin作為其重要的標志物，在EMT進程中發(fā)揮著關鍵作用：E-cadherin是維持上皮細胞間緊密連接的重要分子，細胞惡性轉化時其表達往往下調(diào)，標志著細胞活動及侵襲能力增強〔17〕，而Vimentin在惡性腫瘤細胞中表達上調(diào)，標志著細胞活動性增強〔18〕。本研究顯示下調(diào)A549細胞UCA1的表達后，E-cadherin表達上調(diào)，Vimentin表達下調(diào)，提示UCA1對肺腺癌細胞EMT進程的促進作用。

綜上所述，本研究明確了UCA1可通過介導肺腺癌細胞EMT進程，促進細胞的增殖、侵襲及遷移。接下來的研究中，我們將通過實驗進一步明確UCA1通過何種方式影響肺腺癌細胞的EMT進程，并通過動物模型明確UCA1對肺腺癌移植瘤及體內(nèi)轉移的影響，為揭示UCA1對肺腺癌發(fā)生發(fā)展的確切作用并指導相關臨床診治工作提供實驗依據(jù)。

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