長期有氧運動對去卵巢大鼠骨組織中內源性硫化氫生成的影響

王 兵 石 瓊

(西安工業大學體育學院，陜西 西安 710032)

目前世界衛生組織已經把骨質疏松列為中老年三大疾病之一，在常見病中該病的發生率居第7位〔1〕。目前骨質疏松的治療途徑多種多樣，主要包括藥物療法及運動治療等。雖然藥物療法的療效比較顯著，但由于存在潛在的副作用和患者心理上和經濟上的壓力等原因，多數患者無法堅持長期治療。而運動療法由于不存在副作用，往往被骨質疏松患者廣泛接受并能長期堅持。臨床和動物實驗均發現有氧運動有助于延緩或減輕老年患者或相關模型動物的骨質疏松的發生進程〔2～4〕。然而其中相關的分子機制至今尚未被完全闡明。硫化氫(H2S)被視為一種污染大氣的有毒氣體；而最近研究發現H2S是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第三種氣體信號分子。內源性H2S主要由3-巰基丙酮酸硫基轉移酶、胱硫醚β合酶、胱硫醚γ分解酶催化合成〔5〕。研究顯示H2S的合成減少可能參與了細胞和組織的老化過程，其中機制涉及氧化應激、SIRT1蛋白的激活、年齡相關基因Klotho的調節等〔6,7〕。本研究探討長期有氧運動對去卵巢大鼠內源性H2S生成的影響。

1 資料與方法

1.1動物和試劑 12周齡雌性SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司)，RIPA 裂解液、RT-PCR試劑盒(Roche羅氏生物試劑)，丙二醛(MDA)試劑盒(上海碧云天生物科技實驗室)，封口膜(PARAFILM公司)。

1.2動物模型和有氧運動 成年雌性SD大鼠30只,隨機分為3組,每組10只。假手術組只切除卵巢旁脂肪組織;其余20只切除卵巢,分為去卵巢組和運動組。上述大鼠試驗期間在相同的實驗條件下給予普通飼料。術后1 w后，開始運動治療。自制大鼠用跑臺，放置于電動跑步機上，傾斜角度10°，第1～2周，每天30 min，速度為8 m/min；第3～4周，每天45 min，速度為12 m/min；接下來的8 w，每天60 min，速度為20 m/min。假手術組和去卵巢組大鼠僅放置于跑臺上，但不轉動跑臺，放置時間與運動組相同。

1.3骨密度(BMD)和骨礦物質含量及生物力學指標檢測 處死大鼠，剝離左側股骨，使用DEXA雙能X線BMD儀檢測大鼠股骨BMD和骨礦物質含量；采用電子萬能試驗儀檢測股骨最大負荷和剛度。

1.4血漿H2S含量檢測 處死大鼠，收集血漿；配制NaHS標準品(10、20、40、60、80 μmol/L)，將H2S探針NDS-Az溶于純酒精中(2.2 mmol/L)，使用96孔板(黑底)，每孔加入NDS-Az探針溶液10 μl，然后加入100 μl的血漿溶液或標準品溶液，輕微振蕩以達到混勻的目的。激發波長360 nm、發射波長528 nm，通過酶標儀讀取數值，最后計算標準曲線并根據標準曲線計算每個樣本血漿中硫化氫的濃度。

1.5胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶mRNA含量檢測 處死大鼠，剝離右側股骨，液氮中磨碎，Trizol溶液抽提總RNA，定量后反轉錄，過程按照說明書進行，靶標基因的引物如下：3-巰基丙酮酸硫基轉移酶：上游引物5′-ggctcagtaaacatcccattc-3′； 下游引物5′-tgtccttcacagggtcttcc-3′。胱硫醚β合酶：上游引物5′-atgctgcagaaaggcttcat-3′； 下游引物5′-gtggaaaccagtcggtgtct-3′。 胱硫醚γ分解酶：上游引物5′-cgcacaaattgtccacaaac-3′；下游引物5′-gctctgtccttctcaggcac-3′。將GAPDH設為內參，上游引物5′-gagctgaatgggaagctcac-3′； 下游引物5′-aaaggtggaggagtgggagt-3′。采用ABI7500定量PCR儀進行檢測。

1.6統計學方法 采用SPSS15.0統計軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1長期有氧運動對去卵巢大鼠骨質的影響 與假手術組相比，去卵巢組股骨BMD和骨礦物質含量明顯下降；而長期有氧運動可以顯著增加股骨BMD和骨礦物質含量(P<0.05)。與假手術組相比，去卵巢組股骨極限負荷和剛度明顯下降；而長期有氧運動可以顯著增加去卵巢大鼠股骨極限負荷和剛度(均P<0.05)。見表1。

2.2長期有氧運動對去卵巢大鼠內源性H2S合成的影響 與假手術組相比，去卵巢大鼠血漿H2S水平明顯下降；而長期有氧運動可以顯著增加去卵巢大鼠血漿H2S水平(均P<0.05)。與假手術組大鼠相比，去卵巢大鼠股骨中H2S合成相關酶：胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶表達明顯降低(均P<0.05)，3-巰基丙酮酸硫基轉移酶的表達無明顯變化(P>0.05)；而長期有氧運動可以顯著增加去卵巢大鼠股骨中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶表達水平(均P<0.05)，但是對3-巰基丙酮酸硫基轉移酶表達無明顯影響(P>0.05)。見表2。

2.3長期有氧運動對去卵巢大鼠MDA的影響 與假手術組大鼠相比，去卵巢大鼠血漿MDA水平明顯增加(P<0.05)；而長期有氧運動可以顯著減少去卵巢大鼠血漿MDA水平(P<0.05)。見表2。

表1 長期有氧運動對去卵巢大鼠的股骨骨質及股骨生物力學特性的影響

與去卵巢組比較：1)P<0.05，下表同

表2 長期有氧運動對去卵巢大鼠內源性H2S合成的影響

3 討 論

在人、鼠等哺乳動物的多種組織和器官中都證實具有內源性H2S的存在〔8,9〕。H2S在體內有兩種存在形式：1/3以H2S分子態存在；2/3以H2S鈉鹽形式存在。兩者之間存在動態平衡，這樣既保持了組織內H2S含量的穩定，又維持內環境酸堿度的平衡〔10〕。H2S的脂溶性較高，非常容易通過細胞膜進行跨膜轉運，這一點對于其在骨組織中的功能和作用具有重要意義。

在MC3T3-E1成骨細胞中，H2S治療可以對抗H2O2誘導的氧化應激損傷，促進骨鈣蛋白的表達〔11〕。長期糖皮質激素的使用可以導致骨質疏松，研究發現地塞米松刺激MC3T3-E1成骨細胞，可以抑制細胞內胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表達；而給予H2S供體治療可以減輕地塞米松誘導的成骨細胞活力下降和凋亡發生〔12〕。有研究顯示單劑量硫氫化鈉的治療可以引起RANKL的表達上調和破骨細胞分化的短暫增加〔13〕。另有研究發現H2S供體治療可以抑制癌細胞誘導的破骨細胞分化并在離體實驗中抑制骨質溶解的發生〔14〕。另外，H2S供體治療還可以抑制尼古丁和脂多糖誘導的人牙周膜細胞的破骨細胞性分化〔15〕；在牙周炎大鼠模型中，H2S治療后，牙糟中破骨細胞數目明顯下降〔16〕。在人間質干細胞中H2S供體治療可以下調RANKL/OPG比例，從而抑制了破骨前體細胞的分化〔17〕。體外實驗發現，H2S還可以抑制基質金屬蛋白酶活性，而該酶對于降解骨組織中彈力纖維具有重要作用〔18〕。在去卵巢大鼠中，雌激素的缺乏誘導了骨質疏松的同時，抑制了骨組織中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表達；在去卵巢小鼠血清中H2S含量明顯降低〔19〕。這一點在本文的研究中得到進一步的證實。給予去卵巢小鼠以H2S供體GYY4137治療，可以增加骨生成，減輕雌激素缺乏導致的骨質丟失〔19〕，提示雌激素缺乏后，內源性H2S的生成減少是促進動物骨質疏松的關鍵因素之一。

前期研究發現長期有氧運動可以增加高血壓大鼠主動脈中內源性H2S的生成，從而起到血管保護的作用〔20〕。另有一項研究顯示太極運動可以增加原發性高血壓患者血漿H2S的含量〔21〕。本研究提示有氧運動可以通過上調骨組織中胱硫醚β合酶和胱硫醚γ分解酶的表達，從而增加內源性H2S的生成，抑制氧化應激，最終有助于減輕由于雌激素缺乏誘導的骨質疏松。

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