表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白-5基因沉默對(duì)人卵巢癌細(xì)胞 A2780增殖、凋亡及侵襲力的影響

李 霞 劉世凱

(滄州市中心醫(yī)院婦一科，河北 滄州 061001)

卵巢癌發(fā)病率僅低于子宮內(nèi)膜癌和宮頸癌，其死亡率則居于婦科疾病第一位〔1～3〕。由于卵巢癌在發(fā)病初期缺乏特定的征象，因此該疾病在診斷時(shí)確診非常之困難。往往在確診時(shí)患者病情已經(jīng)發(fā)展到了進(jìn)展期或者晚期，臨床上卵巢癌的治療多以手術(shù)切除輔以放療和化療；這也給患者生理上造成了巨大的損傷和影響。表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)-5能夠通過(guò)脂肪酸代謝產(chǎn)物調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖活化；國(guó)內(nèi)外諸多研究發(fā)現(xiàn)該蛋白表達(dá)水平在原發(fā)性肝癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等細(xì)胞進(jìn)行異常增殖活動(dòng)時(shí)顯著上調(diào)〔4～10〕。此外，F(xiàn)ABP-5的異常表達(dá)對(duì)膽管細(xì)胞癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌侵襲力有顯著上調(diào)作用〔11～13〕。周玲麗等〔14,15〕成功通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默人肝癌細(xì)胞FABP-5基因，成功阻斷了細(xì)胞有絲分裂，有效抑制其增殖活性及其侵襲力。該研究表明FABP-5可能是癌癥治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。本文探討FABP-5基因沉默對(duì)人卵巢癌A2780細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料及來(lái)源 胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自Heraeus Sepatech 公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購(gòu)自Hyclone，Trizol試劑盒購(gòu)自Invitrogen；二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測(cè)試試劑盒(增強(qiáng)型)、5×十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、20×三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)緩沖液等購(gòu)自南京建成生物。兔抗人FABP-5抗體購(gòu)于北京百邁客生物科技有限公司，鼠抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)于艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。生理鹽水從上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院購(gòu)進(jìn)。本試驗(yàn)細(xì)胞處理等過(guò)程中使用的超凈工作臺(tái)由藝斯高上海貿(mào)易有限公司提供。

1.2人卵巢癌細(xì)胞A2780體外培養(yǎng)模型建立及實(shí)驗(yàn)分組 將自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院購(gòu)進(jìn)的凍存卵巢癌A2780細(xì)胞置于60℃恒溫水浴箱，30 s內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞的快速?gòu)?fù)蘇。融化之后將細(xì)胞迅疾轉(zhuǎn)入EP管并加入DMEM培養(yǎng)基，重復(fù)小心吹打細(xì)胞使其在培養(yǎng)基中均勻分布。將復(fù)蘇后的細(xì)胞用LG-DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整為1×106/ml的密度培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為三組，分別為FABP-5 siRNA組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。FABP-5 siRNA組細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染FABP-5 siRNA，陰性對(duì)照組細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒；空白對(duì)照組細(xì)胞不進(jìn)行任何處理。

1.3基因轉(zhuǎn)染 單鏈DNA oligo引物退火配對(duì)形成雙鏈DNA后，通過(guò)其兩端所含酶切位點(diǎn)直接連入酶切后的RNA干擾慢病毒載體上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的單克隆菌落先進(jìn)行PCR鑒定，PCR鑒定陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒載體。包裝制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質(zhì)粒，備用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

基因轉(zhuǎn)染前，胰酶消化取出的細(xì)胞，將之制成5×104/ml細(xì)胞懸液并接種于6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。陰性對(duì)照組加入空載載體(LV-shRNA-NC)，空白對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到20%～30%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每孔均加入Polybrene及感染增強(qiáng)液，轉(zhuǎn)染的感染復(fù)數(shù)(MOI)為10。每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染96 h后熒光最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染后4～5 d收獲細(xì)胞。

1.4逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)FABP-5 mRNA水平的表達(dá) 取三組細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)檢測(cè)表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)-5基因表達(dá)和Western印跡進(jìn)行其蛋白表達(dá)水平的試驗(yàn)。每個(gè)檢測(cè)重復(fù)3次。通過(guò)Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，F(xiàn)ABP-5上游引物：5′-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3′，下游引物：5′-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3′，擴(kuò)增片段212 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′，下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′，擴(kuò)增片段121 bp。提取細(xì)胞RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用2-ΔΔCt分析法，GAPDH基因作為內(nèi)參，2-ΔΔCt即反映FABP-5 mRNA相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)目的基因FABP-5 mRNA的表達(dá)情況。

1.5Western印跡檢測(cè)FABP-5蛋白水平的表達(dá) 取三組細(xì)胞，根據(jù)BCA試劑盒(購(gòu)自北京益德益華生物有限公司)提取并測(cè)定三組細(xì)胞蛋白濃度，簡(jiǎn)而言之：將細(xì)胞裂解并將其稀釋至相同的蛋白濃度，100℃煮沸5 min使蛋白變性。每組取蛋白40 μg，行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)(70 V，30 min；100 V，90 min)；轉(zhuǎn)膜(200 mA，3 h)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4℃過(guò)夜)；一抗1∶500，室溫孵育2 h(或4℃過(guò)夜)；四聚丙烯(烷基)苯磺酸鹽(TPBS)洗滌3次，PBS洗滌1次；之后進(jìn)行Western印跡的反應(yīng)，拍照記錄之后進(jìn)行軟件的圖像分析，測(cè)定三組細(xì)胞中FABP-5蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)水平。

1.6細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8法測(cè)定細(xì)胞體外增殖能力 在人卵巢癌A2780細(xì)胞經(jīng)過(guò)FABP5 siRNA和空載質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后繼續(xù)將之培養(yǎng)，分別測(cè)定轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞的增殖活化能力。對(duì)三組細(xì)胞分別采用CCK-8法各組細(xì)胞的增殖活化能力，簡(jiǎn)而言之：轉(zhuǎn)染48 h之后，將三組細(xì)胞分別收集接種到細(xì)胞培養(yǎng)96孔板上，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)；細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁后繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向各個(gè)孔中分別加入20 μl CCK-8試劑后振蕩均勻；放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)1 h，之后取出酶標(biāo)儀測(cè)定OD 490 nm的吸光度值。

1.7流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期和凋亡的變化情況 細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，將各組卵巢癌細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出。各組人卵巢癌A2780細(xì)胞分別采用碘化丙啶(PI)染色后通過(guò)流式細(xì)胞法檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率變化。首先配置染色劑PI〔含有50 mg/L PI，20 mg/L核糖核酸酶(RNase)A，1 g/L枸椽酸鈉，pH 7.4〕，4℃避光保存。取出轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的三個(gè)處理組細(xì)胞，PBS洗滌幾次后吹打重懸，使細(xì)胞密度達(dá)到約5×105個(gè)/ml；用-20℃預(yù)冷、終濃度為75%的乙醇溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，-20℃放置過(guò)夜；取出固定完畢的細(xì)胞樣品，離心棄上清后加入預(yù)冷的PBS，再次離心棄上清收集細(xì)胞；加入核糖核酸酶A試劑重懸細(xì)胞消化30 min，再加入PI溶液，4℃黑暗處理?xiàng)l件下染色30 min。將細(xì)胞樣品轉(zhuǎn)移到流式細(xì)胞儀的檢測(cè)管中進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，根據(jù)細(xì)胞有絲分裂各個(gè)時(shí)期DNA含量的變化規(guī)律進(jìn)行細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)。

1.8沉默F(xiàn)ABP-5基因?qū)2780細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響 人卵巢癌 A2780細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行測(cè)定，轉(zhuǎn)染后，用10 μl加樣槍尖在每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔內(nèi)劃痕(作為0 h)；用記號(hào)筆在細(xì)胞培養(yǎng)板底部隨機(jī)標(biāo)記5個(gè)觀察點(diǎn)，PBS洗滌細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞；加入無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞36 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞的劃痕愈合能力。重復(fù)3次。將凍存于-20℃冰箱的Matrigel膠提前1 d 4℃過(guò)夜融化，鋪膠。向三組卵巢癌細(xì)胞中加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基制成4×105/ml細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液加入細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)小室，并小心將其放置入24孔板孔之中。在孵育箱中孵育24 h后取出小室，將之放于甲醇液中固定15 min下室面，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，高倍鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1FABP-5 mRNA水平的表達(dá) 空白對(duì)照組(1.68±0.25)與陰性對(duì)照組(1.57±0.26)卵巢癌細(xì)胞中FABP-5 m RNA相對(duì)表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但與此二組相比，F(xiàn)ABP-5 siRNA組 FABP-5基因表達(dá)水平(0.87±0.27)顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 各組FABP-5 mRNA表達(dá)電泳圖

2.2FABP-5蛋白水平的表達(dá) 空白對(duì)照組(2.68±0.25)和陰性對(duì)照組細(xì)胞中FABP-5蛋白相對(duì)表達(dá)水平(2.59±0.24)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FABP-5 siRNA組中FABP-5蛋白相對(duì)表達(dá)水平(1.47±0.28)顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

2.3細(xì)胞體外增殖能力 與空白對(duì)照組(0.901±0.049)和陰性對(duì)照組(0.896±0.048)相比，F(xiàn)ABP-5 siRNA組細(xì)胞增殖水平(0.213±0.022)顯著降低(P<0.05)；與空白組和陰性對(duì)照組相比，基因沉默組分別降低了76.8%和76.9%。

圖2 各組FABP-5蛋白表達(dá)電泳圖

2.4細(xì)胞周期和凋亡的變化情況 空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比，有絲分裂期各個(gè)時(shí)期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，F(xiàn)ABP-5 siRNA組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度明顯減慢，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)；與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，F(xiàn)ABP-5 siRNA組細(xì)胞的凋亡率明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.5細(xì)胞遷移及侵襲能力 空白對(duì)照組〔(89.38±2.63)%〕與陰性對(duì)照組細(xì)胞遷移率〔(90.42±2.43)%〕差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是FABP-5 siRNA組〔(14.40±2.52)%〕則顯著降低，較二者分別降低75%和76%。見(jiàn)圖3。空白對(duì)照組〔(65.38±2.15)%〕和陰性對(duì)照組〔(64.87±2.43)%〕細(xì)胞的侵襲率，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而細(xì)胞FABP-5 siRNA組轉(zhuǎn)染后細(xì)胞侵襲率〔(42.10±2.07)%〕較其他兩組顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

表1 各組細(xì)胞周期和凋亡的變化情況

與空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組：1)P<0.05，2)P<0.01

圖3 各組卵巢癌A2780細(xì)胞遷移能力(×200)

圖4 各組卵巢癌A2780細(xì)胞侵襲能力(×200)

3 討 論

FABP是細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)脂質(zhì)代謝反應(yīng)的一個(gè)蛋白家族，與機(jī)體代謝和炎癥通路也密切相關(guān)〔16～19〕。FABP可高親和性地與疏水性基團(tuán)，如長(zhǎng)鏈脂肪酸等脂類物質(zhì)可逆性結(jié)合；其在脂質(zhì)代謝旺盛的組織細(xì)胞中(如肝細(xì)胞等)表達(dá)最為強(qiáng)烈，其參與脂肪酸代謝〔20～23〕。該家族根據(jù)不同的組織表達(dá)差異性，分為9個(gè)成員，其中FABP-5主要來(lái)源于表皮細(xì)胞；主要調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)〔24〕，結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)維甲酸，活化過(guò)氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)β/δ，是細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化物質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，促進(jìn)增殖并抑制凋亡〔14〕。本研究提示載體構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染是成功的。通過(guò)基因沉默F(xiàn)ABP-5的表達(dá)，顯著降低了卵巢癌細(xì)胞的增殖活性，提高了細(xì)胞的凋亡率，并將細(xì)胞阻滯在DNA合成前期。

研究表明在乳腺癌細(xì)胞、肺鱗癌細(xì)胞〔10，25，26〕增殖過(guò)程中FABP-5基因顯著上調(diào)，這提示FABP-5可能與其增殖活性相關(guān)。研究顯示FABP-5基因上調(diào)可能提高了肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力〔27，28〕；有研究通過(guò)慢病毒RNA干擾FABP-5基因，顯著降低了肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡〔14，15〕。本研究首次表明，F(xiàn)ABP-5基因沉默可抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖活化。FABP-5可與細(xì)胞核內(nèi)的PPARβ/δ和維甲酸X受體(RXR)結(jié)合為PPRE啟動(dòng)原件，激活促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的PDK1和抑制細(xì)胞凋亡分化的Akt信號(hào)通路，提高細(xì)胞的增殖活化能力〔29〕。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的主要區(qū)別除了細(xì)胞增殖失控外，還表現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞具有特殊的侵襲和遷移的能力〔30～32〕。本試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)癌細(xì)胞的擴(kuò)散起到顯著的抑制作用。Jing等〔33〕通過(guò)給前列腺癌模型大鼠轉(zhuǎn)導(dǎo)FABP-5轉(zhuǎn)染子，顯著增加了模型大鼠的腫瘤和轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量；這提示FABP-5對(duì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲遷移有重要促進(jìn)作用；FABP-5的這一特性在其他腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移活性研究中也得到了證實(shí)〔34，35〕。

這可能與FABP-5介導(dǎo)的鈣離子信號(hào)傳導(dǎo)通路和細(xì)胞黏附分子表達(dá)有關(guān)，研究顯示FABP-5可捕獲鈣連接蛋白并與之形成復(fù)合體，定向性地轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞周邊，降低細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和分泌〔29〕，黏附分子的缺乏提高了癌細(xì)胞的浸潤(rùn)性。本試驗(yàn)通過(guò)基因沉默F(xiàn)ABP-5的表達(dá)，降低了人卵巢癌細(xì)胞增殖活化能力和侵襲遷移活性，F(xiàn)ABP-5 siRNA基因轉(zhuǎn)染可能是治療宮頸癌的有效方法。

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