抗腫瘤靛紅衍生物的C-3羰基立體選擇性還原與活性研究

趙 雪，郝思雨，彭小林，李學慧，吳 萌，陳文竹，孫 華

(天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

靛紅又名二氫吲哚-2，3-二酮，在多種植物中廣泛分布，如歐洲菘藍(Isatis tinctoria)、蝦脊蘭(Calanthe discolor)、炮彈果(Couroupita guianensis)等[1]．近年來的研究顯示，靛紅衍生物在體內和體外可以抑制多種腫瘤，其中一些衍生物已經成功用于治療癌癥，包括長春堿(vinblastine)[2]、長春新堿(vincristine)[3]、舒尼替尼(sunitinib)[4]．其中，舒尼替尼又名SU11248，是一種口服的小分子多靶點受體酪氨酸激酶抑制劑，具有抑制腫瘤血管生成和抗腫瘤細胞生長的多重作用，是多個國家和地區晚期腎細胞癌的一線治療藥物[5]．

本課題組的前期研究[6]發現，靛紅衍生物 HKL-2c具有良好的體外抗腫瘤活性，對多種腫瘤細胞的IC50達到40～70,nmol/L．因此，該化合物正在進行進一步衍生化，以期發現結構新穎且藥理活性理想的靛紅衍生物．目前，對于靛紅衍生物 C-3羰基的區域選擇性和立體選擇性的還原，只有C-3羰基還原成3β-羥基的報道[7-8]，但對于還原成 3α-羥基尚未見報道．因此，為了進一步獲得更多的衍生物用于活性篩選，本研究通過微生物催化的方法獲得了3α-羥基的靛紅衍生物．利用 X單晶衍射和核磁共振方法確定產物的結構，并進行體外抗腫瘤活性評價．

1 材料與方法

1.1 材料

D(+)-蔗糖、D(+)-葡萄糖、硝酸鈉、硫酸鎂、氯化鉀、FeSO4·7H2O、磷酸氫二鉀、無水硫酸鈉、瓊脂粉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司．

康寧木霉(Trichoderma koningii)AS3.4290購自中國普通微生物培養物保藏中心(CGMCC)，保存于-20,℃的20%,甘油儲備液中．

PRMI-1640細胞培養液、F12營養培養基、DMEM 低糖培養基、巴西胎牛血清、0.25%,胰蛋白酶(1×)溶液、青霉素-鏈霉素溶液，賽默飛世爾科技公司；噻唑藍(MTT)，北京索萊寶科技有限公司；喜樹堿，分析純，北京偶合科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，分析純，美國 Amresco公司；本實驗使用的靛紅衍生物 HKL-2c由天津科技大學生物工程學院藥物設計與合成研究室合成與保存．

TX323L型電子分析天平，島津國際貿易有限公司；Model 3100,series型CO2培養箱、Multiskan MK3型基礎酶標儀，賽默飛世爾科技公司；CKX41型奧林巴斯倒置顯微鏡，奧林巴斯(中國)有限公司；TGL-20M 型高速臺式冷凍離心機，湘儀離心機儀器有限公司；Vortex-6型漩渦混合器、LX-300型迷你離心機，海門其林貝爾儀器制造有限公司；YXQ-LS-50SI型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博迅實業有限公司；循環水式真空泵，河南省予華儀器有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司；低溫恒溫反應浴，鞏義市京華儀器有限公司；Av-400,MHz型核磁共振儀，瑞士 Bruker 公司；Rigaku Saturn CCD 單晶衍射儀，日本株式會社理學公司；ZWY-2102型回旋式恒溫調速搖瓶柜，上海智城分析儀器制造有限公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備廠；WS2-134-75 型電熱恒溫培養箱，天津市實驗儀器廠．

1.2 微生物轉化

1.2.1 康寧木霉AS3.4290培養基

斜面培養基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，瓊脂 20 ．

發酵培養基(g/L)：馬鈴薯 200，葡萄糖 20，磷酸二氫鉀 3，硫酸鎂0.2，碳酸鈣0.2．

1.2.2 轉化底物溶液的配制

將化合物 1(HKL-2c)用 DMSO溶解，質量濃度為100,g/L．

1.2.3 康寧木霉AS3.4290對化合物1的轉化反應

將保藏菌種接種到 PDA斜面培養基上，30,℃恒溫培養72,h，用接種環刮取菌落表面的孢子接種于含有 100,mL發酵培養基的 250,mL培養瓶中，30,℃、120,r/min 搖床培養 48,h．以 1%,的接種量轉移到新鮮培養基中，30,℃、120,r/min 搖床培養24,h．加入底物溶液100,μL，使轉化液中化合物1的質量濃度達到0.1,g/L，30,℃、120,r/min 繼續培養 7,d，終止發酵．1.2.4 產物的分離純化與結構鑒定

轉化反應結束后抽濾分離菌絲體和發酵液．分別用乙酸乙酯萃取菌絲體和發酵液，振蕩，重復 3次，合并萃取液，減壓蒸發除去溶劑，得到轉化產物的粗品．對粗轉化產物進行硅膠柱色譜分離，石油醚與乙酸乙酯體積比分別為 100∶0、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1．產物用氯仿和己烷重結晶，得到化合物2，黃色結晶，產率為23%,．

1.3 醋酸酐乙酰化

化合物 2(100,mg，0.31,mmol)溶于乙酸酐(5,mL)中回流反應 2,h．冷卻至室溫后，反應液用乙酸乙酯(50,mL)稀釋，有機相依次用飽和碳酸氫鈉水溶液(50,mL)萃取 1次，飽和氯化鈉水溶液(50,mL)萃取 2次．有機相用無水硫酸鈉干燥，除去溶劑．對粗品進行硅膠柱色譜純化(石油醚與乙酸乙酯體積比為5∶1)，得到化合物3，白色結晶，產率為98%,．

1.4 體外抗腫瘤活性的測定

分別取對數生長期的人慢性髓原白血病細胞K562、人肝癌細胞 HepG2和人結腸癌細胞 HT-29，用 0.25%,胰蛋白酶消化，以 5×104,mL-1細胞密度接種于 96孔培養板內，每孔 100,μL，置于 37,℃、5%,CO2培養箱孵育 24,h．靛紅衍生物組(化合物 1—3)加藥終濃度為 10,μmol/L、1,μmol/L、0.1,μmol/L、10,nmol/L、1,nmol/L．同時設置等體積 DMSO 溶劑對照組和陽性對照組(喜樹堿)，每組設 3個平行孔．24,h后每孔加入藥物 0.5,μL，溶劑對照組加入等體積DMSO．37,℃、5%,CO2培養箱孵育48,h后，每孔加入 MTT 20,μL，37,℃、5%,CO2培養箱繼續孵育 4,h后終止培養．棄去培養基上清液，每孔加入 DMSO 100,μL，置于培養箱 10,min， 臜使甲 結晶充分溶解，酶標儀 492、630,nm 波長下測定吸光度，用 Graph Pad Prism 5.0軟件計算藥物對細胞生長的半數抑制濃度IC50值．

2 結果與分析

2.1 化合物1的生物轉化與結構鑒定

課題組前期篩選了多種微生物，發現康寧木霉AS3.4290對化合物1的C-3羰基具有選擇性還原能力．因此，利用康寧木霉對化合物 1進行了生物轉化．對獲得微生物轉化的化合物 2純品進行了質譜測試，相對分子質量為 322.2([M-H]-)，說明產物加了兩個氫(化合物 1的相對分子質量為 321.3)，初步說明是還原產物．并對化合物 2進行了核磁共振氫譜和碳譜測試與分析，進一步確定了化合物2為還原產物，但難以確定還原的位置以及羥基的構型．

2.2 化合物2的乙酰化與結構鑒定

由于化合物 2易被氧化，穩定性較差，為了獲得穩定的產物用于進一步結構解析，對化合物2的羥基進行了乙酰化，得到化合物 3(圖 1)．對化合物 3首先進行了核磁共振和質譜測試，但仍難以確定 3-羥基的構型．因此，進一步獲得了化合物 3的單晶，并進行了X單晶衍射測定，結構如圖2所示，化合物的3位乙酰氧基為α-構型，從而推斷出不穩定化合物 2的3-羥基為α-構型．

圖1 HKL-2c的微生物轉化與乙酰化Fig. 1 Biotransformation and acetylation of HKL-2c

圖2 化合物3的單晶結構圖Fig. 2 Single crystal structure of compound 3

2.3 化合物光譜數據

(S，E)-3-(1-芐基-3-羥基-2-羥基吲哚-5-基)丙烯酸甲酯(化合物 2)：1H NMR(400,MHz，CDCl3)3.78(s，3H)，4.89(s，2H)，5.22(s，1H)，6.33(d，1H，J＝16.0,Hz)，6.72(d，1H，J＝8.0,Hz)，7.27～7.37(m，6H)，7.62(d，1H，J＝16.0,Hz)，7.67(s，1H)．13C NMR(100,MHz，CDCl3)δ 44.0，51.7，69.5，109.7，116.4，124.2，127.3，127.3，127.6，128.0，128.9，128.9，129.8，130.9，134.8，144.1，144.7，167.5，177.0．ESI-MS 322.0 [M-H]-．

(S，E)-3-(3-乙酰氧基-1-芐基-2-氧代二氫吲哚-5-基)丙烯酸甲酯(化合物 3)：1H NMR(400,MHz，Acetone-d6)2.22(s，3H)，3.71(s，3H)，4.79(s，2H)，6.15(d，1H，J＝12.0,Hz)，6.71(d，1H，J＝8.4,Hz)，7.18～7.27(m，7H)，7.48(d，1H，J＝15.6,Hz)，7.60(d，1H，J＝8.0,Hz)．13C NMR(100,MHz，Acetone-d6)δ 19.6，43.9，50.7，109.5，109.5，116.2，127.1，127.1，127.1，127.2，127.2，128.5，128.5，128.5，131.7，135.5，143.7，146.3，166.5，169.3．ESI-MS 363.8 [M-H]-．

2.4 靛紅衍生物體外抗腫瘤活性測定結果

以喜樹堿為陽性對照，通過 MTT法檢測化合物1—3對人源性肝癌細胞 HepG2、人源性結腸癌細胞HT-29、白血病細胞K562體外抗腫瘤活性，結果見表1．與化合物 1相比，化合物 2的抗腫瘤活性保持較好，而化合物3的活性有所下降，說明3位羰基或羥基是活性必需的．

表1 靛紅衍生物 1—3抑制 K562、HepG2、HT-29細胞增殖的IC50值Tab. 1 IC50 of indole derivatives 1-3 inhibiting for K562，HepG2 and HT-29 cell proliferation

3 結 論

目前，對于靛紅母核的還原只有利用硼氫化鈉將C-3羰基還原成 3β-羥基的報道，但尚未見還原成3α-羥基報道．本研究通過微生物轉化的方法，利用康寧木霉菌株獲得了靛紅類衍生物的 C-3羰基還原為 3α-羥基的產物，由于產物的不穩定性，利用其乙酰化產物間接確定了產物的結構，單晶衍射結果確證了羥基的絕對構型．其體外抗腫瘤活性測試表明，羰基還原為 3α-羥基后，抗腫瘤活性保持，對 3種腫瘤細胞株K562、HepG2和HT-29的抑制活性均高于陽性對照組．本研究為靛紅類衍生物 3位羰基區域性和立體選擇性還原開辟了新的方法，為該類化合物的衍生化和構效關系研究奠定了基礎．

［1］ Silva J F M D，Garden S J，Pinto A C. The chemistry of isatins：A review from 1975 to 1999[J]. Journal of the Brazilian Chemical Society，2001，12(3)：273-324.

［2］ Pandya P，Agarwal L K，Gupta N，et al. Molecular recognition pattern of cytotoxic alkaloid vinblastine with multiple targets[J]. Journal of Molecular Graphics &Modelling，2014，54：1-9.

［3］ Yoh K，Goto K，Ishii G，et al. Weekly chemotherapy with cisplatin，vincristine，doxorubicin，and etoposide is an effective treatment for advanced thymic carcinoma[J]. Cancer，2003，98(5)：926-931.

［4］ Hartmann J T，Kanz L. Sunitinib and periodic hair depigmentation due to temporary c-KIT inhibition[J]. Archives of Dermatology，2008，144(11)：1525-1526.

［5］ U. S. Food and Drug Administration. FDA approves new treatment for gastrointestinal and kidney cancer[EB/OL].[2006-01-26].https：//www.fda.gov/NewsEvents/Newstoom/Press-Announce-ments/2006/ucm108583.htm.

［6］ Han K，Zhou Y，Liu F，et al. Design，synthesis and in vitro cytotoxicity evaluation of 5-(2-carboxyethenyl)isatin derivatives as anticancer agents[J]. Bioorganic Medicinal Chemistry Letter，2013，24(2)：591-594.

［7］ Bricout H，Carpentier J F，Mortreux A. Further developments in metal-catalysed CC bond cleavage in allylic dimethyl malonate derivatives[J]. Tetrahedron Letters，1997，38(6)：1053-1056.

［8］ Sonderegger O J，Bürgi T，Limbach L K，et al. Enantioselective reduction of isatin derivatives over cinchonidine modified Pt/alumina[J]. Journal of Molecular Catalysis A Chemical，2004，217(1)：93-101.