丁苯酞對慢性腦缺血大鼠海馬iNOS及MG表達的影響

馮 濤 楊霄鵬

1)南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院神經內科，河南 南陽 473058 2)鄭州大學第二附屬醫院神經內科，河南 鄭州 450014

隨著老齡社會的到來，慢性腦缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)伴發的Alzheimer’s病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆(vascular dementia，VD)等多種腦血管疾病受到社會的廣泛關注，已成為社會問題。近些年來對慢性腦缺血導致的腦損傷機制及防治研究較少。在慢性腦缺血的病理過程中誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達增多，加速鈉離子內流，是腦損傷的重要機制[1]。小膠質細胞(MG)是顱內重要的免疫炎癥細胞，參與慢性腦缺血病理損傷過程。本研究采用雙側大鼠頸總動脈永久結扎的方法制作大鼠慢性腦缺血模型，觀察慢性腦缺血對大鼠學習記憶能力、海馬區iNOS、OX42表達及神經元數目及給予丁苯酞干預后對上述指標的影響，探討丁苯酞的腦保護機制。

1 材料

1．1動物及分組挑選雄性健康SD大鼠48只，清潔級，體質量(210±20)g，鄭州大學醫學院實驗動物中心供。實驗SD大鼠在造慢性腦缺血模型前3d帶回實驗室。避免刺激，實驗室溫度保持21～26 ℃，濕度適宜。自由進食水。隨機將60只SD大鼠均分4組：正常大鼠組為A組、假模型組為B組、模型組為C組、丁苯酞干預組為D組，每組12只，造慢性腦缺血模型前12 h禁食水。

1．2藥物與試劑iNOS抗體、Ox42(MG的標志)抗體、SP9001試劑盒、DAB試劑盒購于北京中杉生物工程公司。多聚甲醛由天津市科密歐化學試劑有限公司提供。磷酸二氫鈉由汕頭市光華化學廠提供。Y型電迷宮(張家港市生物醫學儀器廠)。采用德國Lecia顯微照像系統采集圖像，應用日本奧林巴斯光學顯微鏡。丁苯酞軟膠囊(恩必普，石藥集團恩必普藥業有限公司)，規格：0.1 g/丸，生產批號：H20050299。

2 方法

2．1制備模型采用永久性結扎雙側頸總動脈建立慢性腦缺血大鼠模型[2]。采用10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉。造模前常規局部備皮、消毒，頸部正中切口，切開皮膚，切口約1.6 cm，分離皮下組織，可見雙側頸總動脈伴行迷走神經，暴露雙側頸總動脈，將其與迷走神經鈍性分離，將雙側頸總動脈近心端及遠心端分別結扎后在結扎之間斷離雙側頸總動脈，局部止血，縫合皮膚，如大鼠自然醒來說明慢性腦缺血模型成功，模型失敗的大鼠等量補齊。假模型組大鼠除不結扎斷離雙側頸總動脈外，同模型組。

2．2動物處理正常大鼠組、假手術及模型組大鼠給予生理鹽水2 mL灌胃，1次/d。丁苯酞干預組在造模型成功后給予丁苯酞軟膠囊0.2 g·kg-1治療12周。各組大鼠實驗結束用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射深度麻醉，從左心室加壓300 mL生理鹽水快速灌洗、灌注，4%多聚甲醛溶液心內灌注固定60 min后取腦，4%多聚甲醛液固定24 h，脫水，浸蠟，石蠟包埋，制石蠟冠狀切片(厚度4 μm)。

2．3指標檢測

2．3．1 Y電迷宮測試：學習記憶能力測試方法采用Y電迷宮方法，將大鼠置入安靜暗室內進行主動逃離學習記憶能力測試。Y電迷宮內有無電流刺激的安全區和有50～70 V交流電的刺激區，無規則反復變換安全區和電刺激區，觀察大鼠逃離電刺激區進入安全區的能力。以大鼠順利到達安全區的電擊次數為學習成績，電擊次數越少表明學習記憶能力強。

2．3．2 免疫組織化學染色(SP法)步驟：采用二甲苯對石蠟冠狀切片進行脫蠟2次，酒精脫蠟2次，蒸餾水清洗2次，檸檬酸修復液高溫修復，低溫維持，室溫冷卻。采用3% H2O2去離子水孵育，PBS液沖洗后滴加山羊血清封閉液，采用內源性生物素進行封閉。滴加一抗OX42抗體(1∶100稀釋)4 ℃過夜。室溫復溫，PBS液沖洗，滴生物素二抗工作液，PBS液沖洗后滴辣根酶液，孵育，PBS液沖洗后神經元呈藍色劑，蘇木素復染，水沖洗后混合液脫色，采用低到高濃度酒精脫水、封片。高倍鏡(400×)下對大鼠海馬區iNOS、MG進行觀測，陽性細胞呈現棕黃色染色改變，采集圖像，分析陽性區平均積分光密度值。

2．3．3 尼氏染色方法：石蠟冠狀切片先脫蠟，采用1%甲苯胺藍在室溫10 min后90%乙醇脫色30 s，無水乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片，神經元呈藍色為尼氏染色陽性細胞，高倍鏡(400×)下觀測計數海馬區神經元陽性細胞。

3 結果

3．1大鼠Y電迷宮測試A、B組大鼠精神正常，反應靈敏，電迷宮訓練達標次數正常。C、D組大鼠表現為精神差，萎靡不振，反應遲鈍，電迷宮訓練達標次數明顯多于A、B組(P<0.01)。D組大鼠電迷宮訓練達標次數明顯少于C組(P<0.01)。見表1。

3．2大鼠海馬區iNOS、OX42的表達A、B組大鼠海馬區iNOS有表達不明顯，C、D組大鼠海馬區iNOS表達明顯增多，多于A、B組(P<0.01)。D組大鼠海馬區iNOS表達較C組明顯下降(P<0.01)。A、B組大鼠海馬區OX42有表達不明顯，C、D組大鼠海馬區OX42表達增多，明顯高于A、B組(P<0.01)。D組大鼠海馬區OX42表達較C組明顯下降(P<0.01)。見表2。

表1 4組大鼠Y電迷宮測試±s，n=12)

注：與A、B相比，1)P<0.01；與C組相比，2)P<0.01

表2 4組大鼠海馬區iNOS、OX42表達±s，n=12)

注：與A、B相比，1)P<0.01；與C組相比，2)P<0.01

3．3大鼠海馬區神經元計數A、B組大鼠海馬區經尼氏染色呈陽性神經元計數(70.89±4.28個)，如圖1、2所示。C組大鼠海馬區經尼氏染色呈陽性神經元計數(19.17±3.04個)，如圖3所示。D組大鼠海馬區經尼氏染色呈陽性神經元計數(38.12±4.11個)，如圖4所示。C、D組大鼠海馬區神經元計數明顯低于A、B組(P<0.01)，D組大鼠海馬區神經元計數較C組明顯增多(P<0.01)。見表4。

表3 4組大鼠海馬區神經元尼氏染色±s，n=12，個/400倍視野)

注：與A、B相比，1)P<0.01；與C組相比，2)P<0.01

圖1 A組大鼠海馬區神經元尼氏染色(×400) 圖2 B組大鼠海馬區神經元尼氏染色(×400)

圖3 C組大鼠海馬區神經元尼氏染色(×400) 圖4 D組大鼠海馬區神經元尼氏染色(×400)

4 討論

慢性腦缺血是慢性腦白質變性和老年性癡呆的重要病理生理因素[3]，抑郁是慢性腦缺血后常見并發癥，國內報道發生率20%～40%[4]，國外報道發生率40%～60%[5]。長期慢性腦缺血抑制神經元胞漿在細胞內定向流動，降低新陳代謝，導致顱內血液和淋巴循環障礙，蛋白合成率下降，抑制神經再生等[6]，慢性腦缺血導致過度炎癥免疫反應加劇氧自由基生成，興奮性氨基酸毒性作用及細胞內鈣離子超載等病理損傷等過程[7-8]。

iNOS是存在人體巨噬細胞內一種重要的合酶[9]，為非鈣離子依賴性，一般生理狀態不表達，在慢性腦缺血損傷時，iNOS逐漸表達，主要分布在神經細胞、炎性細胞、神經膠質細胞，顱內海馬部位表達最明顯[10]。一旦誘導合成，就持續大量產生一氧化氮(NO)。NO具有擴張腦血管、調節血壓及腦血流等作用，大量產生的NO與陰離子結合形成過氧化亞硝酸鹽(ONOO-)和羥自由基(OH-)，導致大量鈉離子和氯離子轉移至細胞內，發生神經細胞水腫，抑制線粒體呼吸，損傷細胞膜，誘導缺血區神經元凋亡[10-11]。iNOS是慢性腦缺血產生過量NO的基礎，是腦慢性缺血損傷的一個重要原因。文獻[12]報道，激活的MG是iNOS的主要來源。

MG廣泛分布在顱內，兼有神經保護和神經毒性免疫細胞，是炎癥免疫的標志[13-18]。慢性腦缺血時MG大量激活，引起血管內皮細胞通透性增高，加重缺血區缺血缺氧，導致更多的氧自由基、縮血管物質生成等，使缺血壞死區范圍擴大[19-22]。所以，抑制慢性腦缺血過程中炎癥反應，抑制MG過度激活，可以減少iNOS過度表達，保護神經元，減輕慢性腦缺血損傷程度，成為臨床上治療慢性腦缺血新的治療方法[23-28]。顱內海馬區血流豐富，對缺血缺氧耐受力差，是慢性腦缺血最敏感區，為MG主要分布區，為臨床觀察慢性腦缺血的最佳部位[29-35]。同型半胱氨酸已成為慢性腦缺血的獨立危險因素，在慢性腦缺血早期血清同型半胱氨酸水平會明顯升高，與MG水平呈負相關性，補充葉酸、維生素B6和維生素B12可安全降低同型半胱氨酸水平[17]，可以抑制MG的過度激活。

丁苯酞是在我國第一個擁有自主知識產權治療缺血性腦血管病的藥物，已廣泛應用到缺血性腦卒中的治療中，取得良好療效。丁苯酞具有明顯的抗缺血、減少腦缺血梗死面積、減輕腦水腫程度，同時具有開放腦缺血區域的微循環，加速側支循環形成、保護線粒體及抗血小板聚集等作用[18-22，36-40]。同時，丁苯酞可以降低血清Cys C水平，減輕血管內皮損傷程度[23-24，41-45]，抑制興奮性氨基酸的大量生成，減少鈣離子超載及凋亡基因的大量產生等相關[25-29，46-51]。

本研究顯示，丁苯酞能明顯提高大鼠的學習記憶能力，抑制海馬區iNOS、MG的過度表達，減少神經毒性因子分泌，抑制慢性腦缺氧大鼠海馬區神經細胞的過度凋亡，具有明顯的腦保護作用，為臨床上應用丁苯酞提供理論依據。本研究還存在對動脈模型觀察時間短，樣本量偏少，不能完全反映慢性腦缺血過程中各項指標的演變過程；另外，海馬區比較彌散，故取材定位缺血區與實際缺血可能有差距等不足之處。

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