丹參多化學成分的UPLC-LTQ Orbitrap MS快速表征解析

張馳，張彩娟，邱敏懿，晉小雁，邵遠洋，劉莉，王敏，盧彥冰，王春國*，王學勇*(.北京中醫藥大學，北京 0009；.貴陽德昌祥藥業有限公司，貴州 貴陽 55000)

丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)為唇形科植物丹參的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》，具有行氣止痛，溫腎散寒的功效[1]，有“一味丹參，功同四物”之譽。丹參主要分布于河北、山西、陜西、山東、河南、江蘇、浙江、安徽、江西及湖南等地。現代藥理研究表明丹參在心血管系統方面能夠改善微循環，改善冠脈循環，在血液系統方面能夠改善血液流變性，促進組織修復和再生，臨床中丹參素在抗心肌梗死、抗動脈粥樣硬化等方面具有確切療效，丹參注射液可用于治療冠心病、胸悶、心絞痛等疾病[2-7]，因此研究其相應的化學物質信息顯得非常有意義。

近年來，UPLC-LTQ Orbitrap MS技術廣泛應用于中藥及復方多成分的鑒定，通過高效液相色譜分離，利用高分辨串聯質譜精確的相對分子質量定性優勢，全面而快速對中藥化學成分進行準確鑒定。目前，丹參藥材中的化學成分主要分為脂溶性成分和水溶性成分，其中脂溶性成分主要是丹參酮類(鄰醌型和對醌型)。水溶性成分主要是丹酚酸類[8-13]。對于丹參藥材的化學成分分析和質量控制，已經進行了大量研究，主要包括HPLC、HPLC-MS等分析手段[14-27]。LTQ Orbitrap MS是將線性離子阱質譜和高分辨質譜結合的雜交型質譜儀，具有多種組合掃描模式，可以提供多達10級的結構碎片信息和100 000以上的分辨率[28]。本研究運用超高效液相色譜-線性離子阱/靜電場軌道阱組合式高分辨質譜聯用技術系統分析了丹參中二萜類、酚酸類、醌類等化學成分，根據丹酚酸B、丹參酮IIA等標準品的碎片信息及質譜裂解規律進行快速篩查，并根據精確分子量及二級碎片信息分析共鑒定出70種化合物，進一步豐富和細化了丹參有效成分信息特征。本研究結果可為丹參化學成分的分析提供一定參考，為丹參藥材品質及質量控制研究提供借鑒。

1 儀器與試劑

LTQ-Oribitrap XL線性離子阱-串聯靜電場軌道阱質譜儀(美國Thermo Scientific公司產品)，配有熱噴霧離子源(HESI)、Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色譜系統(含二元梯度泵，自動進樣器，柱溫箱)、DAD檢測器、Millipore Synergy UV型超純水機(美國Millipore公司)、R200D型電子分析天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)；SY-601型超級恒溫水浴(天津歐諾儀器儀表有限公司)、水為超純水，甲醇、甲酸、乙腈均為質譜級。丹酚酸B(批號111562-200504,純度≥98%)購買于中國食品藥品檢定研究院、丹參酮IIA(批號130602,純度≥98%)購買于成都普菲德生物技術有限公司、原兒茶醛(批號110810-200506,純度≥98%)購買于中國食品藥品檢定研究院、隱丹參酮(批號110852-200806,純度≥98%)購買于中國食品藥品檢定研究院、二氫丹參酮I(批號13082317,純度≥98%)購買于中國食品藥品檢定研究院。丹參藥材經北京中醫藥大學王學勇教授鑒定其原植物為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)。

2 方法

2.1 標準品溶液配制

精確稱取標準品丹酚酸B 5.4 mg，原兒茶醛5.2 mg，二氫丹參酮I 5.4 mg，隱丹參酮4.9 mg，丹參酮IIA 4.9 mg，用甲醇溶解，并在10 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，得標準品溶液濃度分別為丹酚酸B 0.54 mg·mL-1，原兒茶醛0.52 mg·mL-1，二氫丹參酮I 0.54 mg·mL-1，隱丹參酮0.49 mg·mL-1，丹參酮IIA 0.49 mg·mL-1。過0. 45 μm微孔濾膜，備用。

2.2 供試品溶液配制

取丹參干燥藥材，進行粉碎，精密稱取藥材粉末0.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，進行超聲提取30 min(功率：200 W；頻率：40 kHz)，搖勻，溶液過濾，取上清。并經微孔濾膜(0.45 μm)過濾，作為供試品溶液備用。

2.3 色譜和質譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH-Cl8柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，色譜梯度洗脫，洗脫程序：0～1 min，4%B；1～2.5 min，4%～13%B；2.5～7.5 min，13%～22%B；7.5～8.5 min，22%～48%B；8.5～12 min，48%～60%B；12～13 min，60%～90%B；13～14 min，90%B。流速為0.4 mL/min，進樣量2 μL，柱溫為35℃。

2.3.2 質譜條件

HESI離子源，正、負離子檢出模式，離子源溫度350 ℃，電離源電壓4 KV，毛細管電壓：35 V，管透鏡電壓：110 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣(純度>99.99%)，鞘氣流速 40 arb，輔助氣流速：20 arb；數據采用傅里葉變換高分辨全掃方式(TF，Full scan，Resolution 30000)數據依賴性(data-dependent acquisistion)ddMS2；母離子列表(Parent ion list)PIL-MS2。

2.4 數據處理

通過Xcalibur2.2和HighChem Mass frontier 7.0軟件，根據目標化合物的相對分子量、同位素峰等信息判斷化合物的元素組成，在總結對照品的碎裂信息及文獻中相關信息并結合化合物的碎片信息，對相關化合物進行結構分析，并根據碎片裂解信息推測并鑒定相應的化合物。

3 結果

根據軟件設定合適的閾值參數，對正、負離子模式下采集到的總離子流圖進行提取，獲得化合物準離子分子峰信息，根據供試品的色譜保留時間、質譜準分子離子峰、碎片離子等信息并結合相關文獻，根據質譜提供的準確相對分子質量計算化合物的精確分子式，再依據高能碰撞下碎片離子信息推測化學成分。本文從丹參質譜正、負總離子圖中(如圖1和2)選擇離子響應效果較明顯的峰，并根據保留時間及相關文獻數據進行對比，共鑒定出丹參類成分70種，其中二萜類成分有50種，包括對醌型二萜類、鄰醌型二萜類及內酯型二萜類；酚酸類成分共鑒定出20種(結果見表1)。

3.1 二萜類成分解析

二萜類成分可分為鄰醌型二萜類，對醌型二萜類以及內酯型二萜類。本實驗共鑒定出二萜類成分50種。根據對照品丹參酮IIA的裂解碎片解析其裂解規律，在LTQ-Orbitrap MS中(R=30 000)，正離子模式下丹參酮IIA準分子離子峰為m/z 295.132 29[M+H]+，CID裂解后，在二級質譜圖中出現碎片離子m/z 280、277、266、249、235、225、207、183等特征碎片離子。由圖3可知碎片離子m/z 280、277主要是丹參酮IIA失去小分子甲基、水形成的；由于丹參酮IIA存在未芳化的A環，其容易失去一分子水，在二級譜圖中主要顯示出[M+H+18]+的質譜峰，同時碎片離子m/z 266是由母離子失去醛基形成的；碎片離子m/z 277失去小分子-CO可形成碎片離子m/z 249。根據碎片離子峰的特點，推斷丹參酮IIA可能的裂解途徑如圖3和圖4所示。

圖1 丹參正離子總離子圖

圖2 丹參負離子總離子圖

圖3 正離子模式下丹參酮IIA的二級質譜圖

圖4 正離子模式下丹參酮IIA的質譜裂解途經

根據標準品丹參酮IIA的裂解規律及碎片離子特征，運用LTQ-Oribitrap MS軟件對丹參藥材中的化學成分進行數據采集，并結合高分辨質譜精確分子量進行鑒定。根據丹參酮IIA m/z 280、 m/z 277、m/z 249等特征碎片及化合物的結構特征，核對相應化合物的碎片裂解信息，對丹參中的二萜類成分進行快速篩查與定性鑒別(表1所示1～50)。

根據丹參質譜的總離子圖進行解析，4號峰在負離子模式下的二級質譜圖中有m/z 280、 m/z 277、m/z 249等同丹參酮IIA有相似的碎片離子，推測其可能是與丹參酮IIA有相似結構的化合物；根據其母離子m/z 295，且可以見到m/z 280的碎片離子，推測其可能是失去一分子甲基；碎片離子m/z 277可能是由于母離子失去一分子水獲得；4號峰中m/z 266、m/z 265信號比較強烈，推測其可能更容易失去一分子醛基。結合丹參酮IIA及丹參酮VI的結構式發現丹參酮VI的結構中更容易失去一分子醛基，故而推測其為丹參酮VI(二級質譜圖如圖5)。

圖5 丹參酮VI二級質譜圖

10號化合物中準分子離子為m/z 277[M-H]-，同時也存在m/z 249、m/z 221、m/z 193等碎片離子， m/z 249的碎片是由基本母核失去一分子CO；m/z 221是由于碎片離子m/z 249丟失一分子CO，進一步丟失一分子CO碎片，形成碎片離子m/z 193。根據其與丹參酮IIA具有相似的碎片離子以及相對分子量，推測其與丹參酮IIA具有相似的基本母核，根據其裂解規律推斷此化合物為次甲丹參醌(二級質譜圖如圖6)

圖6 次甲丹參醌二級質譜圖

表1 UPLC-LTQ Orbitrap MS鑒定丹參藥材二萜類及酚酸類成分

續表1

*標記的為與標準品對照鑒定的化合物

3.2 酚酸類成分解析

酚酸類成分在負離子模式下有較好的離子響應。本研究從丹參的甲醇提取液中共鑒定出20種酚酸類成分。酚酸類成分在負離子模式下容易電離，根據酚酸類成分主要結構類型，判斷其有失去-CO2、CO、H2O等中性碎片離子的特點，并根據酚酸類成分的基本母核及碎片信息進行相應化合物的推斷。本實驗共鑒定出酚酸類成分20種[30-31](表1所示51～70)。

根據對照品丹酚酸B在負離子模式下的碎片裂解信息推斷其主要的裂解行為。對照品丹酚酸B的準分子離子是m/z 717.1450111[M-H]-，CID裂解后，得到碎片離子m/z 537、519、493、457、377、339、321、295等特征碎片離子，其中碎片離子m/z 537是由母離子發生酯鍵斷裂失去C9H9O4得到的；m/z 493是由母離子失去C10H9O6得到；碎片離子m/z 519和m/z 321分別由分子離子峰失去C9H10O5和C9H10O5得到；分子離子峰m/z 339是由m/z 519失去C9H9O4得到的；m/z 295是由m/z339失去一分子-COOH得到的。根據碎片離子峰的特點，推斷丹酚酸B可能的裂解途徑如圖7和8[29]。

圖7 負離子模式下丹酚酸B的二級質譜圖

圖8 負離子模式下丹酚酸B的質譜裂解途經

38號化合物的二級質譜圖的碎片離子主要有m/z 179、169、153、135、123、109、73，其質荷比為m/z 197，其中碎片離子m/z 179是由母離子失去一分子H2O得到的，進一步丟失一分子CO2得到碎片離子m/z 135；m/z 169是由母離子失去CO得到，進一步丟失-CH2O2得到碎片離子m/z 123；碎片離子m/z 153由分子離子峰失去一分子CO2得到。根據碎片離子峰的特點，推斷丹參素可能的裂解途徑如圖9和10。

圖9 正離子模式下丹參素的二級質譜圖

圖10 正離子模式下丹參素的質譜裂解途經

52號化合物的二級質譜圖同標準品丹酚酸B的二級質譜圖相似，均具有m/z 537、519、493、457、377等的碎片離子，且保留時間也與標準品一致，故而推斷此化合物為丹酚酸B，其二級質譜圖如圖11所示。

57號化合物其相對分子質量為339，主要的碎片離子有m/z 321、m/z 295、m/z 280、m/z 185等。酚酸類成分極易失去CO、CO2、H2O，碎片離子m/z 321主要是由于母離子失去一分子H2O得到的；而m/z 295就是由m/z 339失去一分子-CO2得到的。根據其裂解方式及相對分子量推斷出此化合物為丹酚酸G，其二級質譜圖如圖12所示。

圖11 丹酚酸B二級質譜圖

圖12 丹酚酸G二級質譜圖

4 討論

本研究首次利用UPLC-LTQ Orbitrap MS技術對丹參中的化學成分進行快速定性鑒別，共鑒定出丹參中的化合物70種，其中二萜類成分50種，為丹參化學成分的定性鑒別提供了一個快捷、高效的方法。相比較于趙新峰[32]在丹參的HPLC-ESI-MSn分析中，共鑒定出15種丹參化合物，本研究共鑒定出70種丹參化合物；對于沈建芳[33]等利用HPLC-MS鑒定出丹參酮類的成分11種，夏光惠[34]等對民間丹參代用品蕎麥地丹參進行定性分析，共鑒定出丹參中二萜類成分16種，本研究利用LC-MS技術鑒定出二萜類成分50種，極大豐富了丹參藥材二萜類的化學指紋信息，為丹參后續研究與開發奠定了重要的分析化學基礎。

本研究所發掘出豐富的丹參化學成分信息，不僅為快速解析不同來源丹參質量比較分析提供化學指紋具有重要意義，而且對于深入揭示“藥材好、藥才好”物質機制有重要價值。此外，該項目成果在深入揭示丹參次生代謝活動，解析丹參功能基因調控機制，揭示藥材品質形成規律，丹參優良種質資源評價等方面，具有重要的學術意義和應用價值。

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