九香蟲血淋巴三種生物分子對胃癌SGC-7901細胞增殖影響

曹米蘭，檀 軍，金道超，郭建軍

(貴州大學 昆蟲研究所/貴州山地農業病蟲害重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

目前，惡性腫瘤已經取代心腦血管疾病成為導致人類死亡的頭號殺手，而胃癌是消化系統最為常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤導致的男性死亡中位列第三，女性位列第五[1]。從天然動植物、微生物中提取針對腫瘤細胞的抗腫瘤活性成分因其毒副作用小，綜合修復等功效一直是抗腫瘤藥物研發的熱點之一[2]。

藥用昆蟲是中國傳統中藥材的重要組成部分，據估計有1700多種傳統的中成藥處方配方中含有昆蟲成分或昆蟲提取物[3]。九香蟲(AspongopuschinensisDallas， 1851)是昆蟲綱半翅目兜蝽科傳統藥用昆蟲[4]，近代醫學研究發現九香蟲具有抗腫瘤、溶解血栓、治療常見的消化道疾病及血管瘤等功效[5-7]，然目前國內學者對九香蟲的研究多限于整蟲或粗提物的藥用療效，已確定的具體藥用成份及功效物質并不多。

鑒于此，本研究采用不同技術手段，分離提取了九香蟲血淋巴中的小分子化合物、蛋白質和多糖等大分子物質，將其分別體外作用于人胃癌SGC-7901細胞，使用MTT法檢測其對SGC-7901增殖抑制情況，初步確定了蛋白質為抑制胃癌細胞增殖的主要活性物質，為藥效成分的分離提取提供直接依據。

1 材料與方法

1.1 材料

九香蟲購自貴州省凱里市下司鎮(東經107.80°，北緯26.52°)，活蟲置于-80℃冰箱冷凍備用。人胃癌SGC-7901細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 主要試劑耗材

DMEM高糖培養基(美國HyClone公司)，胎牛血清(FCS，杭州四季青生物公司)，青鏈霉素混合液(100×)(北京Solarbio公司)，噻唑藍(3-(4，5-dimethyl thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)(美國Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Amresco公司)，Amicon Ultra-4超濾管(美國Millipore公司)，丙酮、無水乙醇等試劑均為國產分析純。

1.3 實驗儀器

酶聯免疫檢測儀(美國BioTek公司)，高速冷凍離心機(美國Thermo公司)，二氧化碳培養箱(美國Thermo公司)，生物安全柜(瑞士ESCO公司)，冷凍干燥機(德國CHRIST公司)，電熱鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.4 實驗方法

1.4.1九香蟲血淋巴制備 取九香蟲活蟲置于-80℃冰箱冷凍，將冷凍后的九香蟲頭和翅膀掰掉，其余部分放于10 mL的注射器內擠壓使其內容物流入離心管中，內容物液體4℃，12000 r/min離心30 min，取水溶性組分再次4℃，12000 r/min離心30 min，取上清液即制得九香蟲血淋巴。

1.4.2超濾分離小分子化合物 取九香蟲血淋巴適量按1∶4的比例稀釋，于4℃，12000 r/min離心30 min后取上清液。上清液轉移至50 mL潤濕的截留量為MWCO 3kDa的超濾管濾膜內，置于高速冷凍離心機4℃，4500×g離心1 h，分別收集濾出液和濾膜內溶液，小分子化合物富集于濾出液內。濾出液置于液氮中速凍20 min，冷凍干燥備用。

1.4.3丙酮沉淀蛋白質 配制濃度為20%、40%、60%和80%(W/V)的丙酮溶液各20 mL放入-20℃冰箱冷凍。取超濾后濾膜內的血淋巴懸液4 mL平均分裝在4個15 mL離心管中，分別加入10 mL預冷的濃度為20%、40%、60%和80%的丙酮溶液，振蕩混合均勻，冰浴20 min。混合液4℃，3500×g離心20 min，棄上清，沉淀使用1 mL超純水溶解。上述步驟重復2次，蛋白沉淀使用超純水反復洗滌3-4次，置于液氮中速凍20 min，冷凍干燥備用。

1.4.4醇提法提取多糖 取超濾后濾膜內的血淋巴懸液1 mL加入9 mL無水乙醇，振蕩混合均勻靜置5 min。混合液室溫，3500×g離心20 min，棄上清液。沉淀使用2 mL超純水溶解，室溫，3500×g離心20 min，吸取上清液加入9 mL無水乙醇，振蕩混合均勻，重復上述步驟2次。多糖提取液置于60℃電熱鼓風干燥箱干燥，完全揮發掉水分和乙醇后，稱重備用。

1.4.5SGC-7901細胞培養 人胃癌SGC-7901細胞使用含10%胎牛血清(FCS)，1%青鏈霉素混合液的DMEM(高糖)培養基，置于37℃，5%CO2濃度的二氧化碳培養箱中培養。隔天換液，細胞鋪滿至細胞培養瓶底部80%時進行傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.4.6MTT法檢測提取物對SGC-7901細胞增殖的影響 使用0.25%胰酶將處于對數生長期的SGC-7901細胞消化下來，調整細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔培養板中，每孔200 μL，置于37℃，5%CO2濃度的培養箱中培養。實驗設實驗組、無藥對照組(細胞組)及空白對照組。九香蟲血淋巴小分子物質、不同濃度的丙酮溶液提取的蛋白質、多糖提取物凍干粉分別稱重，使用DMEM培養基溶解，配制相同質量濃度的供試樣品溶液。待細胞貼壁后，吸掉實驗組培養液，分別加入供試樣品：小分子物質、蛋白提取物、多糖提取物溶液，設置質量濃度梯度為50、100、200 mg/L，每個濃度梯度設5個復孔。藥物作用48 h后，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續培養4 h后，吸去培養液，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，恒溫搖床震蕩10 min以徹底溶解紫色結晶。使用酶標儀在570 nm波長檢測吸光度(A)值。每組實驗重復3次，取均值。計算細胞增殖抑制率，抑制率(%)=(實驗組A值-空白組A值)/(無藥組A值-空白組A值)×100%。

1.5 數據處理

2 結果與分析

2.1 不同濃度的丙酮對蛋白質提取效率影響

各丙酮濃度提取的蛋白質作用于SGC-7901細胞，經MTT法檢測結果顯示，20%、40%、60%和80%(W/V)的丙酮提取的蛋白質成分在不同的濃度梯度作用48 h對SGC-7901細胞增殖均有抑制作用。隨著丙酮濃度的增加，蛋白質的提取效率增強，對SGC-7901細胞增殖抑制作用也顯著增強，使用60%丙酮處理的血淋巴樣品與其他處理組相同作用濃度相比抑制率最高，其差異具有統計學意義(P<0.05)，當樣品作用濃度為200 mg/L時抑制率最高為68.28%。同時相同質量體積比的丙酮處理的九香蟲血淋巴隨著樣品作用濃度的增大，抑制

圖1 不同濃度丙酮處理九香蟲血淋巴作用48 h對SGC-7901細胞體外增殖影響Fig.1 The proliferation effects of A. chinensis haemolymph handled by acetone at different concentrations on SGC-7901 cells in vitro for 48 h

活性增強，呈一定的濃度依賴性關系，其差異具有統計學意義(P<0.05)。當丙酮濃度增加到80%時，高劑量的丙酮對蛋白質活性成分結構和功能具有破壞作用，造成活性蛋白質不可逆的變性失活，在相同作用濃度其對SGC-7901細胞增殖抑制作用顯著低于20%、 40%、60%丙酮處理的血淋巴樣品，當樣品作用濃度為100 mg/L時抑制率最高為16.30%。因此，60%丙酮溶液處理的九香蟲血淋巴可達到最高的蛋白質提取效率，選擇這一處理組的蛋白質提取物與其他成分進行活性比較。

2.2 MTT法檢測九香蟲血淋巴三種成分對SGC-7901細胞增殖影響

使用超濾分離小分子化合物，60%(W/V)丙酮提取蛋白質成分，醇提法提取多糖成分，三種成分分別作用于SGC-7901細胞48 h，通過MTT法檢測各樣品對胃癌SGC-7901細胞的體外增殖影響，結果如表1，圖2所示。其中蛋白質提取物和小分子物質作用48 h各濃度梯度對SGC-7901細胞增殖均具有抑制作用，表現出一定的濃度依賴性關系，且在較高的作用濃度條件下，蛋白質提取物的增殖抑制活性顯著高于小分子物質(P<0.05)，表明蛋白質成分具有較高的抑制胃癌細胞增殖活性。多糖提取物各作用濃度與無藥對照相比均無明顯的抑制活性(P>0.05)，且隨著樣品濃度的增加抑制率逐漸降低，當樣品濃度為100、200 mg/L時，對SGC-7901細胞表現出促進其增殖的效果。因此，蛋白質提取物與小分子物質、多糖成分相比對SGC-7901細胞生長抑制作用最強。

表1 九香蟲血淋巴三種成分作用48 h對SGC-7901細胞增殖抑制率Tab.1 The cell proliferation inhibition effects of three elements from A. Chinensis haemolymph(48 h)

注：數據為平均值±標準誤。表中同一列小寫字母不同表示同一處理不同濃度下在0.05水平上差異顯著，同一行大寫字母不同表示相同濃度不同處理下在0.05水平上差異顯著。

圖2 九香蟲血淋巴三種成分作用48 h對SGC-7901細胞體外增殖影響Fig.2 The proliferation effects of three elements from A.chinensis haemolymph on SGC-7901 cells in vitro for 48 h

3 結論與討論

昆蟲是世界上最昌盛的動物類群，種類繁多，個體數量大，分布廣泛，其中藥用昆蟲作為資源昆蟲的一大類群，在中國已有3000多年的歷史[8]。迄今已有記述的藥用昆蟲隸屬于14目63科200多種，在《中國藥用動物志》中共記述了藥用昆蟲145種[9]，其中有8目14科約77個種的昆蟲可用于癌癥治療[10]。九香蟲具有廣泛的藥理活性，對胃癌、食道癌、乳腺癌、子宮頸癌和喉癌具有顯著的療效[11-12]。民間中醫常以整蟲或粗加工的九香蟲入藥治療多種疾病，國內學者對九香蟲抗癌活性研究報道中，大多是以粗提物為作用對象進行藥理活性研究，而并未明確具體的藥效成分。

本研究初步分離九香蟲血淋巴小分子化合物、蛋白質及多糖三種成分并比較其對人胃癌SGC-7901細胞生長的影響。九香蟲血淋巴通過截留量MWCO 3kDa的濾膜并施以膜內外一定的壓力差，初步分離富集小分子物質，進一步向九香蟲血淋巴懸液中加入預冷的丙酮可使蛋白質脫去水化層并降低介電常數，使蛋白質容易凝聚而沉淀。通過MTT法檢測九香蟲各成分抑癌活性，各組分相同質量體積比作用于SGC-7901細胞對其增殖影響具有顯著差異，其中蛋白質成分活性最高，其次為小分子物質，而多糖物質幾乎沒有表現出抑癌活性。小分子化合物相比于蛋白質、多糖等大分子物質在相同的質量濃度作用下其摩爾濃度顯著高于大分子物質，因此進一步反映蛋白質的活性顯著高于小分子化合物。

蛋白質和天然小分子化合物是昆蟲抗腫瘤藥物的主要成分。例如斑蝥素是斑蝥分泌的一種有毒的萜類化合物，斑蝥素及其衍生化合物被證實具有抑制多種體外及體內動物模型的腫瘤細胞增殖的活性，張衛東等[13]研究發現斑蝥素能誘導人肺癌A549細胞發生凋亡，李曉飛等[14]研究發現斑蝥素對喉癌和胃癌細胞具有顯著的抑制作用。本研究發現九香蟲血淋巴中的小分子化合物也表現出一定的抑制胃癌細胞增殖活性，具體的藥效成分有待進一步運用各種層析色譜技術分離。蛋白多肽類藥物可作用于DNA，阻止基因表達，而多數活性肽通過促使細胞膜溶解，阻滯細胞分裂周期等方式誘導癌細胞凋亡，如蜂毒肽(Melittin，MEL)、蛾血素等。蜂毒肽是從歐洲蜜蜂(Apismellifera)毒素中提取的多肽分子，是迄今為止發現的抗腫瘤活性最強的多肽，對多種體外作用癌細胞和細菌均有明顯的殺傷效果，包括卵巢癌、乳腺癌、肝癌、白血病等[15]。九香蟲血淋巴的蛋白類成分表現出較強的抑制胃癌細胞增殖活性，具體的活性肽和抑癌機理有待進一步研究。本研究初步判定九香蟲血淋巴抑制胃癌SGC-7901細胞增殖的有效成分為蛋白類物質。這一發現為九香蟲抗癌活性成分的分離純化提供依據，為九香蟲這一藥用昆蟲資源的開發以及抗腫瘤新藥物研發奠定基礎。

參 考 文 獻：

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