不同炮制方法對大棗中環磷酸腺苷含量的影響

劉世軍，王 林，唐志書*，宋忠興，崔春利，劉紅波，梁艷妮，張 娛，許洪波，史鑫波，雷甜甜

(1.陜西中醫藥大學/陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712083；2.陜西省中藥基礎與新藥研究重點實驗室，陜西 咸陽 712083；3.陜西省風濕與腫瘤類中藥制劑工程技術研究中心，陜西 咸陽 712083）

大棗是鼠李科灌木植物棗（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果實。大棗甘、溫。歸脾、胃經，具有補中益氣、養血安神的功效[1]。十棗湯用大棗10枚煎湯送服，取其益脾緩中，防止逐水傷及脾胃，并緩和諸藥毒性[2-3]。小建中湯用大棗補脾而緩急止痛[4]。《本草綱目》記載將其作為丸劑的輔料使用[5]，張仲景的一些方劑[6]以及現在治療失眠的許多處方都有大棗[7-9]。大棗中含有豐富的環磷酸腺苷[10]。環磷酸腺苷為參與調節細胞功能的第二信使物質，其作用非常廣泛。經常食用大棗可以增加人體白血球內環磷酸腺苷的作用，具有良好的鎮靜、催眠和降壓的作用[11]，還能有效減輕化學藥物在人體的堆積對肝臟的損傷；可以增加人體免疫細胞內環磷酸腺苷的含量，從而抑制人體在受到外界刺激時所產生的免疫反應，降低過敏反應的發生[12]。本實驗通過醋炙、酒炙、醋蒸、酒蒸、三蒸三制、炒焦等炮制方法對大棗進行炮制后，采用高效液相色譜法測定炮制前后樣品中環磷酸腺苷的含量。

1 儀器與試藥

Waters e2695高效液相色譜儀、2998型紫外檢測器（美國Waters公司）；高效液相色譜柱為Agilent TCC18（250×4.6 mm，5 μm）；高速萬能粉碎機（天津鑫博得儀器有限公司）；101型電熱鼓風烘箱（北京科偉永興實驗有限公司）；KQ-300DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TG328B型分析天平（上海天平儀器廠）；溶劑過濾器（天津市津騰實驗設備有限公司）；中國藥典標準藥篩二號篩（浙江省上虞市大亨橋化驗儀器廠）。環磷酸腺苷對照品（批號為16082301），購于陜西樂博生化科技有限公司；甲醇（邁瑞爾上海實驗設備有限公司），為色譜純；磷酸二氫鉀（天津市盛奧化學試劑有限公司），為分析純；水為超純水；大棗購于陜西合陽；陳醋（岐山天緣食品有限公司）；白酒（北京二鍋頭酒業股份有限公司）。

2 方法與結果

2.1 大棗炮制品的炮制方法

2.1.1 大棗生品 取同一批次的大棗搶水洗干凈，烘干，用時剖開。

2.1.2 醋蒸大棗[13]取潔凈大棗適量，剖開，加入20%的陳醋浸潤，待醋被吸收完全后，放入蒸鍋內蒸至顏色呈暗紅色，取出放涼，干燥。

2.1.3 醋炙大棗[13]取潔凈大棗適量，剖開，加入20%的陳醋浸潤，待醋被吸收完全，文火炒干并至表面微黃色，香味溢出。

2.1.4 酒蒸大棗 取大棗適量，剖開，加入10%的酒將大棗浸潤，蒸制0.5 h放涼，取出，干燥。

2.1.5 三蒸三制 取潔凈大棗適量，至鍋內隔水蒸制0.5 h，取出放涼，重復3次，取出，干燥即可。

2.1.6 酒炙大棗 取大棗適量，剖開，加入10%的酒將大棗浸潤，文火炒至香味溢出。

2.1.7 炒焦大棗[14]將適量大棗取出剖開，置鍋內于武火炒至外表皮破裂，表面有焦斑。

2.2 大棗的預處理 將炮制后的大棗和生品干燥后用粉碎機粉碎，分別過二號篩，裝于密封袋中，在避光干燥處保存。

2.3 大棗中環磷酸腺苷含量的測定方法

2.3.1 色譜條件的選擇 高效液相色譜柱為Agilent TCC18（250×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.03 mol/L K2HPO3（A）-甲醇（B）溶液；梯度洗脫，梯度洗脫程序為0～25 min時10%（A）:90%（B），25～30 min時10%～50%（A）:90%～50%（B），30～40 min時50%（A）:50%（B），40～50 min時，10%（A）～90%（B）。流速為1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL[15]。

2.3.2 色譜峰的確定 取配制好的并且已經過了0.45 μm微孔濾膜的環磷酸腺苷標準品溶液適量，在已經設置好的擬定色譜條件下進樣10 μL，通過對照標準品出峰的時間和位置來分析樣品中環磷酸腺苷的出峰位置。見圖1。

圖 1 環磷酸腺苷對照品的高效液相色譜圖

2.3.3 對照品溶液的制備 精密稱定環磷酸腺苷對照品5.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加入超純水溶解至刻度，制成混合對照液。再吸取對照品溶液4.9、2.45、1.225、0.613、0.306 mL，分別置于10 mL的容量瓶中，加超純水稀釋并定容至刻度線，配制成濃度分別為50、25、12.5、6.25、3.125 mg/L的標準對照品溶液，用時再經過0.45 μm的微孔濾膜過濾。

2.3.4 供試品溶液的制備 精密稱取炮制好的大棗粉末各1 g，置于100 mL的錐形瓶中，加入超純水20 mL，稱定質量，超聲提取40 min，冷卻，再稱重并補足減失的質量，搖勻，濾過，然后轉移到容量瓶中定容至25 mL，經過0.45 μm的微孔濾膜過濾，即得供試品溶液[20]。

2.4 線性關系考察 取已制備好的不同濃度的標準品溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，測定其所對應的峰面積。以溶液濃度為橫坐標，測得的峰面積為縱坐標，繪制大棗環磷酸腺苷標準曲線。得出的標準曲線回歸方程為：Y = 21 342X+7 175.8，R2= 0.999 2（n = 5）。從結果中可以得出環磷酸腺苷含量在0.031 25～0.5 μg的范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 精密量取濃度為12.5 mg/L的環磷酸腺苷對照品溶液，在相同的色譜條件下注入高效液相色譜儀，每次10 μL，重復進樣6次。測定環磷酸腺苷的峰面積RSD為1.73%（n = 6），表明儀器的精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗 精密稱取已炮制處理好的醋炙后的大棗粉末1 g，按照2.3.4下的制備方法來制得1份供試品溶液，并放于室溫下密閉保存。取同一供試品溶液，分別在0、2、4、8、12 h下，于相同色譜條件中分別進樣10 μL，測定醋炙大棗中的環磷酸腺苷峰面積的RSD為1.74%，表明在12 h內炮制大棗供試品溶液在室溫下穩定性良好。

2.5.3 重復性實驗 精密稱取同一批酒炙的樣品，按照2.3.4下的方法制備6份供試品溶液，在相同色譜條件下進樣，進樣量為10 μL，然后分別測量環磷酸腺苷的面積并計算其含量。結果得出樣品中環磷酸腺苷含量的RSD為0.5% ，表明應用的方法重復性良好。

2.5.4 加樣回收實驗 量取已知含量的同一炮制品粉末0.5 g，共稱取5份，精密稱定，置于錐形瓶中。再分別加入已配置好的濃度為102 mg/L的環磷酸腺苷對照品溶液1.5 mL，然后按照樣品溶液配制方法配制成供試品溶液，在同一色譜條件下分別進樣10 μL，測定環磷酸腺苷的峰面積并計算加樣回收率，平均回收率98.29%，RSD 0.74%。

2.6 樣品的含量測定 分別取已配制好的大棗生品和醋炙、酒炙、醋蒸、酒蒸、三蒸三制、炒焦的大棗炮制品供試品溶液各10 μL，在相同擬設定的色譜條件下注入高效液相色譜儀，測定大棗中環磷酸腺苷的峰面積，并按照所求得的線性回歸方程計算大棗中環磷酸腺苷的含量。見表1。

表1 不同炮制方法下大棗中環磷酸腺苷的含量

3 討論

經與未經炮制的大棗生品比較發現，經過炮制的大棗中環磷酸腺苷含量均有提高，其中經過醋蒸的大棗環磷酸腺苷含量增加最為明顯。炮制后的環磷酸腺苷含量增加的原因可能是因為環磷酸腺苷為水溶性物質，能與醋酒結合，而且經過蒸制后，蒸汽里的水分進大棗內部，使環磷酸腺苷有效溶出，增加了含量。在炒焦時，由于大棗表皮結構緊密，經過武火炒炙，其表皮遭到破壞后破裂，使得大棗內部受熱面積增大，更容易讓其有效成分受熱溢出。本次實驗結果表明，運用高效液相色譜法檢測炮制大棗中環磷酸腺苷的含量，精密度高、操作簡單、可以重復檢測。

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