BDNF對缺糖缺氧小鼠伏隔核中突觸前膜蛋白Synapsin-1的影響

喻曉路 ，傅慧

1.徐州醫科大學江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇徐州 221004；2.淄博市第一醫院神經內一科，山東淄博 255000

突觸是神經元上不可或缺的一部分，它在維持神經元之間相互聯系方面起到巨大作用[1]。正確的突觸形成是神經系統結構和功能的基礎，突觸形成用突觸前膜蛋白Synapsin-1進行表示[2]。BDNF(brain derived neurotropic factor,腦源性神經生長因子)是一種重要的神經因子，在生理環境下具有促進突觸的形成、維持神經系統的功能[3-6]。伏隔核(nucleus accumbens,NAc)是中腦一邊緣多巴胺系統環路的重要核團，NAc具有行為調控、鎮痛作用、參與精神分裂癥的產生、藥物成癮、學習記憶和調節心血管活動及調節運動活動等功能[7]。腦組織的缺糖缺氧是腦缺血患者的主要癥狀之一，其對腦組織中的神經元會產生損傷，尤其是對神經元突觸有著很大的影響[8]。該次對比了腦片培養技術和細胞培養技術，認為腦片培養技術與細胞培養技術相比更多的保留了細胞和組織結構，能夠更好的模擬生理狀態，并且操作更簡便，對實驗設備的要求也不高[9-10]。該實驗采用腦片培養的方法，目前此方法已經成熟，見圖1，圖中神經元形態清晰。該實驗于2017年12月—2018年2月期間在徐州醫科大學麻醉學重點實驗室將18只小鼠中共隨機分為3組，對小鼠NAc腦區的腦片進行缺糖缺氧處理和復灌，并與加入BDNF的處理組進行比較，對Synapsin-1蛋白的表達量進行測定，明確BDNF在缺糖缺氧條件下小鼠NAc腦區的作用，為腦缺血病患者所進行溶栓治療的方法提供有力的實驗依據。

圖1 腦片培養伏隔核HE染色20X

1 資料與方法

1.1 一般資料

SPF級昆明小鼠18只，體重25～30 g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，標準化飼養。

1.2 儀器和試劑

材料：BDNF（2837）購自 TOCRIS 公司，RIPA 裂解液（KGP702-100）購自凱基生物公司，低糖DMEM培養基（ABB210359）和 EBSS 培養基（AB10134597）均購自HyClone公司，青鏈霉素混合液（VC2003）購自 VICMED 公司，Synapsin-1 （5297）-抗購自 Cell Signaling Technology 公司，GAPDH （10494）-抗購自proteintech公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗 （A0208）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（P0009）購自碧云天生物技術有限公司，ECL發光試劑盒（AC36131）購自 bioworld 公司，Transwell 24 孔板細胞培養小室（3413）購自Corning公司，PVDF膜（IPVH00010）購自Immobilon公司，自動震動切片機購自萊卡公司，化學發光儀購自BIO-RAD公司，其余自配液體試劑均購自sigma公司。自配溶液：高滲糖溶液Sucrose 254 mM,D-Glucose 10 mM,NaH2PO41.25 mM，NaHCO324 mM，MgSO4·7H2O2mM,KCl 3mM,CaCl2·2H2O 2 mM，用去離子水溶解。使用前通入95%O2+5%CO230 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 腦片制備實驗動物經七氟烷誘導麻醉后，迅速斷頭，然后用剪刀剪開兩耳間的皮膚直至兩鼻間，然后翻轉皮膚，暴露顱骨。用眼科剪去掉小鼠顱骨，暴露全腦。隨后用眼科鑷伸入腦前端下部的嗅球處，輕輕挑起腦的前端，剪斷腦神經，翻轉全腦，放入冰冷、預先通95%O2+5%CO2混合氣 30 min的高滲糖溶液中，放置1～2 min。取出全腦，除去小腦和嗅球，用刀片切取鼠腦前中部，迅速用502膠水將腦組織塊底部粘在自動震動切片機的緩沖槽中，用高滲糖溶液浸沒組織塊，設置自動震動切片機的切片速度、厚度和距離，切取含有NAc腦區的厚度為300 μm的腦片，大約可以取3～5片，用小刀切去多余組織，只保留NAc區域，整個過程在8 min內完成，高滲糖溶液溫度維持在4℃。24孔培養板孔內加0.5 mL的腦片培養液，即低糖DMEM培養基，其中包括1%青鏈霉素混合液，將取好的腦片移入Transwell的小室中，盡量完全吸取高滲糖溶液，將小室放入培養板中，使培養基的液面剛好達到腦片的水平，但不漫過腦片，將培養皿置于37℃培養箱中的自制密閉容器中，自制密閉容器有輸入和輸出氣體的導管。腦片培養基的組成：低糖DMEM+1%的青鏈霉素混合液。腦片的培養條件為：溫度37℃，持續穩定通入95%O2+5%CO2混合氣體，微生物培養箱中培養。要保證腦片的上表面充分暴露于氣體環境中。

1.3.2 充N2法制備腦片缺氧缺糖模型 將缺氧缺糖組的腦片更換為EBSS培養基，并移進充入5%CO2+95%N2混合氣體的密閉容器中，在37℃培養箱中是以0.5 L/min的流量充入混合氣，于15 min后換成低糖培養基并復氧，通入95%O2+5%CO2混合氣體，在37℃培養箱中復灌培養1 h。

1.3.3 分組 正常組：選取正常昆明小鼠6只，取NAc腦區，采用低糖DMEM培養基并通入95%O2+5%CO2混合氣體進行培養。

缺糖缺氧復灌組（OGD/R）：選取正常昆明小鼠6只，取NAc腦區，采用EBSS培養基并通入5%CO2+95%N2混合氣體進行培養15 min，并進行復灌，即將帶有腦片的小室置入加入DMEM培養基的培養皿中，并持續通入95%O2+5%CO2混合氣體1 h。

缺糖缺氧復灌給藥組（OGD/R+BDNF）：選取正常昆明小鼠6只，取NAc腦區，采用在EBSS培養基中加入 BDNF（BDNF用量為 50 ng/μL）并通入 5%CO2+95%N2混合氣體進行培養15 min，并進行復灌，即將帶有腦片的小室置入加入DMEM培養基的培養皿中，并持續通入95%O2+5%CO2混合氣體1 h。

1.3.4 對檢測樣品的制備和免疫印跡分析 在模型制作完成后，將腦片移入潔凈的EP管中，加入蛋白裂解液，用電動勻漿器將組織打碎，充分裂解組織，4℃10 000轉離心30 min，棄去沉淀，將上清液移入新EP管中，并做好標記。用BCA試劑盒進行蛋白定量，測定蛋白濃度，將樣品配平，按照每孔20 ng的蛋白量進行上樣跑電泳，采用半干轉的方式將膠中的蛋白轉到 PVDF膜上，5%的脫脂奶粉封閉 1 h，移入Synapsin-1（1:1 000）一抗和 GAPDH（1:5 000）一抗中4℃過夜，室溫復溫30 min,washing buffer清洗3次，5 min/次，轉入HPR標記的兔二抗中孵育 40 min，washing buffer清洗3次，15 min/次。用化學發光儀進行曝光記錄。用ImageJ軟件進行定量分析。

1.4 統計方法

采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據處理，采用單因素方差分析，（one-way ANOVE）進行組間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

正常組Synapsin-1蛋白的相對表達量為（1.191 02±0.068 371），缺糖缺氧復灌組Synapsin-1蛋白的相對表達量為（0.7919 35±0.093 63），缺糖缺氧復灌給藥組Synapsin-1蛋白的相對表達量為 （1.065 35±0.075 595）。通過對正常組、缺糖缺氧復灌組和缺糖缺氧復灌給藥組的小鼠NAc腦區的Synapsin-1蛋白的相對表達量進行比較，通過蛋白免疫印跡的檢測結果顯示，缺糖缺氧復灌組與正常組相比Synapsin-1蛋白的相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01），缺糖缺氧復灌給藥組與缺糖缺氧復灌組相比Synapsin-1的蛋白相對表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。缺糖缺氧復灌給藥組與正常組相比Synapsin-1的蛋白相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 Synapsin-1表達水平比較

3 討論

腦部缺糖缺氧是腦缺血病患的主要癥狀，它可以導致人類殘疾或者死亡，眾多的研究表明腦組織的缺糖缺氧會誘發一系列的病理變化，甚至短暫性的缺糖缺氧也會對神經元造成一定的損傷[8]。由于神經元在接收和發送信號時必須要形成突觸結構，所以對于突觸的影響是最關鍵的[1]。有報道稱BDNF具有神經保護和神經營養的作用，可以幫助神經損傷后傳導功能的恢復[3-6]。缺糖缺氧對腦組織的損傷尤其表現在突觸形成上，在與行為、疼痛、精神分裂癥、藥物成癮、學習記憶和心血管活動及運動活動等功能密切相關的NAc腦區其代表突觸形成的突觸前膜蛋白Synapsin-1的表達量就有明顯的降低。在缺糖缺氧的條件下加入BDNF，能有效減緩Synapsin-1蛋白表達量的降低。實驗結果顯示正常組Synapsin-1蛋白的相對表達量為 （1.191 02±0.068 371），缺糖缺氧復灌組Synapsin-1蛋白的相對表達量為 （0.791 935±0.093 63），缺糖缺氧復灌給藥組Synapsin-1蛋白的相對表達量為（1.065 35±0.075 595）。缺糖缺氧復灌組與正常組相比Synapsin-1蛋白的相對表達量降低，差異有統計學意義（P＜0.01），缺糖缺氧復灌給藥組與缺糖缺氧復灌組相比Synapsin-1的蛋白相對表達量升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。缺糖缺氧復灌給藥組與正常組相比Synapsin-1的蛋白相對表達量差異無統計學意義（P＞0.05）。采用建立NAc腦區腦片缺糖缺氧的模型，很好的模仿了短暫性腦缺血的癥狀，同時加入BDNF的實驗，驗證了BDNF在短暫性缺糖缺氧對NAc腦區突觸前膜蛋白有保護作用，以此說明在腦缺血患者的治療上如果使用BDNF會有效緩解由于缺糖缺氧造成的神經元的損傷，對于BDNF未來運用于臨床治療上具有參考價值。

現有的報道稱BDNF作為一種重要的腦源性神經生長因子對于腦神經元都起到很好的保護和營養作用，其中也包括NAc腦區，將 BDNF注入老年大鼠伏隔核可以改善認知和結構突觸可塑性[11]。 而對Sy napsin-1蛋白在伏隔核的研究僅限于抑郁癥等精神類疾病的研究上，文獻報道中提到的使用VGF在伏隔核中的Synapsin-1蛋白的表達會有變化[12]。對于由于腦缺血所造成的缺糖缺氧癥狀而引起對于神經元的損傷方面卻沒有研究，該的研究正好填補了這一空白。

綜上所述，BDNF在小鼠伏隔核缺糖缺氧條件下，Synapsin-1蛋白的表達量比未使用BDNF的蛋白表達量升高，說明BDNF可以有效的提高神經元突觸前膜蛋白的表達，從而說明可以保護神經元，給BDNF的臨床應用提供了實驗依據，若對BDNF的作用機制和作用效果進行更進一步的研究，將會改善由于腦缺血造成的神經系統疾病的治療方法。此研究前景非常廣闊。

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