回回藥方圣世散對先兆流產小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3表達的影響?

鄧玉娥，杜小利，李 娜，蘇 莉，張艷春

(寧夏醫科大學， 銀川 750004)

先兆流產是婦產科多發病之一，現代醫學認為其病因多見免疫因素、遺傳因素、內分泌因素、子宮解剖異常、感染因素等[1]。 目前，妊娠免疫耐受機理是國內外研究的熱點。研究表明，在調節母胎界面免疫耐受中，Th1/Th2型細胞因子平衡是調節母胎免疫的關鍵,當正常妊娠母胎界面Th1/Th2平衡遭受破壞，Th1過度表達，將導致流產的發生[2]。細胞因子信號傳導負調控因子SOCS1、SOCS3在胚胎期參與調節T細胞的分化調節Th1/Th2細胞因子的平衡，以維持正常妊娠[3]。

先兆流產屬于中醫學“胎漏”“胎動不安”等范疇，中醫學認為先兆流產多因腎虛胎元失固引起。回回藥方圣世散源于《回族醫方集萃》[4]，原方由桑寄生、菟絲子、阿膠、白術、蕨麻、苧麻根、杜仲、續斷8味中藥組成，具有補腎安元、益氣固脫之功。臨床研究表明，圣世散可調節先兆流產患者血中HCG、E2及P水平，改善其黃體功能，保胎有效率達88.6%[5]。目前對圣世散發生藥效的分子機制研究尚無報道，故動物實驗通過檢測先兆流產小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達含量，從分子水平初步探討圣世散保胎的免疫機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級6～8周齡18～22 g雌性CBA/J小鼠60只，雄性DBA/2小鼠24只，雄性BALB/C小鼠6只，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動物許可證號SCXK(京)2014-0004)。

1.2 實驗藥物

圣世散飲片購自寧夏明德中藥飲片有限公司，經寧夏醫科大學附屬回醫中醫醫院中藥房中藥師鑒定合格。將8味藥水煎回流濃縮至含生藥量1 g/mL，4 ℃保存備用。

1.3 實驗儀器與試劑

1.3.1 儀器 冰凍切片機、電熱恒溫培養箱、生物組織包埋機、OLYMPUS BX51- DP71研究級正置熒光顯微鏡。

1.3.2 試劑 SV0002-兔IgG兩步法免疫組化試劑盒、兔多克隆抗體SOCS1、SOCS2、SOCS3、DAB顯色試劑盒等。

2 方法

2.1 分組與造模

將雌性CBA/J小鼠48只與雄性DBA/2小鼠24只按2∶1的比例合籠隨機分為先兆流產模型組和圣世散高、中、低劑量組，次日早晨取雌鼠檢查陰道栓，以孕鼠陰道口用無菌小棉簽探測到有血且體質量明顯下降，而無妊娠物排出確定為先兆流產癥狀；將雌性CBA/J小鼠12只與雄性BALB/C小鼠6只按2∶1比例合籠建立正常妊娠組，同法觀察記錄受孕情況。

2.2 分組與給藥

各組從妊娠第0天開始灌胃給藥，圣世散低、中、高劑量組給藥劑量分別為含生藥量3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg，正常妊娠組及先兆流產模型組給予相同體積蒸餾水，連續灌胃14 d。

2.3 標本采集與處理

2.3.1 計算各組孕鼠胎盤平均質量 孕鼠連續灌胃給藥14 d，末次給藥1 h后取胎盤組織計數并稱總質量。胎盤平均質量=胎盤總質量÷胎盤個數，比較各組胎盤平均質量差異。

2.3.2 免疫組化染色 取孕鼠蛻膜和胎盤組織石蠟包埋，冰凍切片機切片(5.0 μm)、貼片，3%雙氧水封閉10 min，5%BSA血清封閉30 min，加一抗(SOCS1、SOCS3、1∶250)過夜，加二抗(聚合HRP標記抗兔IgG)，DAB顯色，蘇木精復染、封片，光鏡下觀察、照相。

2.3.3 HE染色 取胎盤組織石蠟切片標本，5%伊紅酒精染色,封片，光鏡下觀察，照相。

3 統計學方法

4 結果

4.1 一般情況

正常妊娠組小鼠精神狀態佳，皮毛有光澤，未見陰道口流血現象。其他各組均出現不同程度精神狀態欠佳、毛色干枯、活動力下降等癥狀，部分可見陰道口有血漬，先兆流產模型對照組表現尤為明顯，各組均未見妊娠物排出。

4.2 5組孕鼠胎盤平均質量比較

表1顯示，與正常妊娠組比較，先兆流產模型組的胚胎質量明顯降低(P<0.05)；與先兆流產模型組比較，圣世散高、中劑量組孕鼠胎盤質量均增加(P<0.05)，圣世散低劑量組無明顯變化(P>0.05)。

表1 各組孕鼠胎盤平均質量比較

注：Fa=5.254，Pa=0.002；與正常妊娠組比較：*P<0.05；與先兆流產模型組比較：#P<0.05

4.3 光鏡觀察結果(HE染色)

圖1顯示， 每組均放大400倍拍攝胎盤蛻膜組織。

圖1 各組小鼠母胎界面HE染色結果(10×40)

4.4 免疫組化染色結果

4.4.1 免疫組化法 表2圖2、3顯示，檢測圣世散對小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達的影響。圖2、3顯示，5組小鼠母胎界面均可見SOCS1和SOCS3蛋白棕黃色陽性表達區域，主要位于細胞質內，細胞核藍染，各組陽性表達強弱不等。

5 討論

正常機體發揮免疫功能的細胞主要是T細胞，CD4+T細胞在接受抗原刺激后可分化為Th1和Th2型2個細胞亞群。Th1主要分泌IL-2(白介素-2)和TNF-α(腫瘤壞死因子-α)，介導細胞免疫反應并參與炎癥反應和組織損傷；Th2主要分泌IL-4、IL-6，介導體液免疫反應，促進抗體形成并抑制免疫炎癥發生，減少細胞過度損傷，抑制Th1型細胞的產生[6]。

表2 各組小鼠母胎界面SOCS1、SOCS3蛋白表達平均光密度值水平比較

注：Fa=41.551，Pa=0.000；Fb=18.327，Pb=0.000；與正常妊娠組比較：*P<0.05；與先兆流產模型組比較：#P<0.05

圖2 各組小鼠母胎界面SOCS1免疫組化染色結果(10×40)

圖3 各組小鼠母胎界面SOCS3免疫組化染色結果(10×40)

正常妊娠期胚胎蛻膜中，由Th1分泌的TNF-α可調節妊娠滋養細胞的生長分化，促進孕酮的分泌，有利于胎兒的生長發育。但過多的TNF-α可促進蛻膜和絨毛膜中前列腺素E2的合成及釋放，導致子宮平滑肌收縮而發生流產[7]；由Th1分泌的IL-2在適量濃度時可發揮特異性免疫屏障的作用，但若IL-2異常上調則會損害胎盤組織[8]；由Th2分泌的IL-4可下調Th1細胞介導的免疫應答，IL-6可調節胎盤激素的合成及胚胎的著床，抑制母體排斥反應以維持妊娠[9]。由此得知，Th1/Th2細胞因子與自然流產有密切關系。

研究認為，人與小鼠免疫網絡Th1/Th2細胞因子的調節主要是被 SOCS1、SOCS3 蛋白所控制[10]。Thl、Th2均可誘導SOCS1、SOCS3產生，而這2種蛋白反過來可抑制上述細胞因子的信號傳導過程[11]。SOCS1主要表達在Th1細胞中，并通過抑制Th2細胞因子的信號傳導通路而抑制其免疫反應；SOCS3蛋白則主要表達在Th2細胞中并通過抑制Th1細胞因子的信號傳導通路而抑制其免疫反應，使T細胞的分化朝著有利于妊娠維持的Th2細胞分化[12]。由此看來，SOCS1、SOCS3對Thl/Th2平衡調節起關鍵作用。

現代藥理學研究表明，補腎健脾中藥有調節免疫-內分泌等多系統的功能，對先兆流產能起到綜合治療的作用[13]。回回藥方圣世散具有補腎安元、益氣固脫之功，為驗證圣世散的臨床療效，杜小利[14]等選取70例患者，其中治療組35例患者給予圣世散煎劑口服，臨床保胎有效率88.6%。對照組35例口服維生素E、肌肉注射黃體酮，保胎有效率74.3%，結果表明圣世散治療先兆流產優于西藥對照組。

實驗選取的CBA/J×DBA/2先兆流產動物模型，其受孕雌鼠CBA/J具有圍著床期反復自然流產的特點，與人類反復自然流產發生時期相似[15]。趙愛民[16]等發現，CBA/J×DBA/2小鼠模型CBA/J孕鼠外周血Thl型細胞因子濃度顯著高于正常妊娠組，而Th2則顯著低于正常妊娠組，這表明CBA/J×DBA/2先兆流產小鼠模型是以Th1/Th2平衡失調為流產機理。

本實驗從Th1/Th2平衡調控蛋白SOCS著手，更深層次地探討圣世散的免疫調節機制。結果表明，正常妊娠組小鼠母胎界面SOCS1低表達，SOCS3

高表達；先兆流產模型組SOCS1表達明顯升高，SOCS3明顯下降；圣世散高、中劑量組SOCS1、SOCS3表達接近正常妊娠組，從而證實圣世散保胎機理可能是通過升高母胎界面SOCS3表達水平，降低SOCS1，促使T細胞的分化偏向于Th2型細胞因子，間接抑制Th1型細胞因子及其胎盤損害作用，維持Thl/Th2平衡而保護胚胎。

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