4種木蘭屬植物花粉萌發特性

俞 芹，王倩穎，王寧杭，王型力，范李節，張明如，申亞梅

（浙江農林大學 風景園林與建筑學院，浙江 杭州 311300）

木蘭屬Magnolia植物分布范圍廣，多為高大喬木或灌木，抗性強，株型優美，早春季節開花，花色艷麗，具有較高的觀賞價值，在園林綠化中應用廣泛［1］，具有廣闊的市場價值。目前，雜交育種是木蘭屬新品種選育的主要手段之一，大部分種間雜交均表現為親和［2］。花粉活力的高低直接影響雜交育種工作的成敗。花粉活力的測定方法有直接授粉、離體萌發、染色法等［3］。直接授粉花粉生活力易受柱頭可授性、授粉時期、花粉與柱頭親和性等因素影響［4］。根據染色原理不同，染色法分為氯化三苯基四氮唑（TTC）、碘－碘化鉀法、聯苯胺法、醋酸洋紅染色法等，該方法雖簡單易操作，但所測得的花粉活力受花粉自身特性的影響較大，如花粉壁的厚度、花粉內各種酶活性的強弱等［5］，未成熟、衰老或敗育的花粉仍能染色［6］。離體培養法為花粉提供的條件與花粉在柱頭內萌發的條件相似［7］，所得花粉活力與花粉在柱頭上的活力最接近，是檢測花粉活力的最佳方法。近年來，已有許多木蘭屬植物花粉形態、生活力及其儲藏特性的相關研究， 如二喬玉蘭Magnolia soulangeana［8］， 天女木蘭 Magnolia sieboldii［9］， 紫玉蘭Magnolia liliflora［10］，景寧木蘭Magnolia sinostellata［11］等，研究表明不同植物適宜的培養基組分及質量濃度要求不同，花粉離體培養中所需的萌發條件也不同。本研究在綜合前人研究的基礎上，以望春玉蘭Magnolia biondii，長花玉蘭 Magnolia ‘Changhua’，丹馨玉蘭 Magnolia ‘Danxin’，黃山木蘭 Magnolia cylindrica等為試驗材料，研究不同培養基組分、培養溫度及時間對花粉萌發的影響。旨在篩選出各植物材料適宜的培養基及花粉萌發最佳條件，為木蘭屬植物的育種工作提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

望春玉蘭、長花玉蘭、丹馨玉蘭、黃山木蘭等4種木蘭屬植物均來自于浙江農林大學苗圃地，將所采集花藥置于硫酸紙上，自然干燥24～36 h，待花藥開裂后收集花粉，并放置于硅膠中干燥，－80℃條件下儲藏備用。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因子試驗 采用離體培養法。蔗糖質量濃度梯度為0，50，100，150，200 g·L－1；硼酸質量濃度梯度為 0， 50， 100， 200， 300 mg·L－1； PEG-4000 質量濃度梯度為 0， 150， 200， 250， 300 g·L－1。

1.2.2 正交試驗 在單因子試驗的基礎上，選取對試驗材料影響較大的培養基組分及質量濃度，進行L9（33）正交試驗（表1），以得到最佳培養基組分。

1.2.3 最佳培養條件的確定 利用最佳培養基，把4種試驗材料分別置于15，20，25，30，35℃下進行離體培養，培養12 h后，根據實驗結果，確定最適萌發溫度。在最適溫度條件下，分別培養3，6，9，12，15 h，確定最佳培養條件。

1.3 試驗方法

采用離體培養法，在雙凹載玻片內滴入培養液，將充分混勻后的花粉均勻點入培養液中，將載玻片置于鋪有濕潤濾紙的培養皿內，25℃，8 400 lx人工氣候培養箱中培養12 h。在顯微鏡下觀察統計，花粉管長度等于或超過花粉粒直徑的花粉即視為已萌發。重復3次·處理－1，觀察視野3個·重復－1，所統計的花粉粒不少于50粒·視野－1。花粉萌發率=（萌發的花粉粒數/視野中花粉粒總數）×100%。

1.4 數據處理

使用Excel 2010對數據進行統計，利用SPSS 22.0對原始數據進行反正弦轉換并進行單因素方差分析（Duncan’s），各處理間差異顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同培養基組分對4種木蘭屬植物花粉萌發的影響

2.1.1 蔗糖對花粉萌發的影響 試驗結果表明：不同質量濃度蔗糖對4種木蘭屬植物花粉萌發率影響顯著（圖1A）。隨著蔗糖質量濃度的增加，4種花粉萌發率均呈先增加后減小的變化趨勢。不同植物最大萌發率及最適蔗糖質量濃度有所不同，望春玉蘭花粉適宜的蔗糖質量濃度為50和100 g·L－1，花粉萌發率分別為62.56%和68.87%，顯著高于其他質量濃度處理下的萌發率（P＜0.05）；當蔗糖質量濃度超過100 g·L－1時，望春玉蘭花粉萌發率下降，但蔗糖溶液中花粉萌發率均高于對照。長花玉蘭在100 g·L－1的蔗糖溶液中，萌發率達最大，為18.02%，顯著高于其他質量濃度處理（P＜0.05）；蔗糖質量濃度為200 g·L－1時，花粉萌發率最低，為9.90%，比對照低1.92%。在各質量濃度蔗糖培養基上，丹馨玉蘭花粉萌發率均低于10%，蔗糖質量濃度為0～100 g·L－1時，花粉萌發率差異不顯著（P＞0.05）；而高質量濃度蔗糖溶液對丹馨玉蘭花粉萌發起抑制作用，150和200 g·L－1蔗糖質量濃度下，花粉萌發率顯著低于對照，分別降低了3.47%和4.42%。黃山木蘭花粉適宜的蔗糖質量濃度為50～100 g·L－1，在此范圍內花粉萌發率顯著高于對照（P＜0.05），在200 g·L－1蔗糖溶液中，黃山木蘭花粉萌發率最低，為2.46%，低于對照22.95%。

2.1.2 硼酸對花粉萌發的影響 硼酸對4種木蘭屬植物花粉萌發均有顯著作用（圖1B）。其中，望春玉蘭花粉在200 mg·L－1硼酸的培養液中萌發率高達79.63%，顯著高于其他質量濃度下花粉的萌發率（P＜0.05），且比對照萌發率高46.89%，高質量濃度的硼酸培養液中花粉萌發率與對照無顯著差異（P＞0.05）。在0～200 mg·L－1硼酸范圍內，長花玉蘭花粉萌發率均隨質量濃度的增加而上升，其最適質量濃度為200 mg·L－1，萌發率為25.57%，顯著高于對照；在300 mg·L－1硼酸條件下，萌發率開始下降。丹馨玉蘭花粉在各質量濃度硼酸條件下萌發率差異均不顯著（P＞0.05），當硼酸質量濃度為50和100 mg·L－1時，花粉萌發率達最大，分別為13.22%和14.93%，對照萌發率最低，為7.27%。黃山花粉萌發率隨著硼酸質量濃度增大而增加，在100 mg·L－1時，其花粉萌發率達最大，為47.09%，顯著高于200 mg·L－1下的萌發率（28.47%），與其他質量濃度培養液中的花粉萌發率差異不顯著（P＞0.05）。

2.1.3 PEG-4000對花粉萌發的影響 隨著PEG-4000質量濃度的增加，4種木蘭屬植物花粉萌發率均呈先增加后減小的變化趨勢（圖1C）。PEG-4000的質量濃度為200和250 g·L－1時，望春玉蘭花粉萌發率達最大，分別為53.92%和51.21%，顯著高于其他質量濃度處理（P＜0.05）。長花玉蘭花粉萌發的最適PEG-4000質量濃度為150 g·L－1，之后隨著PEG-4000質量濃度的增加，花粉萌發率降低；當質量濃度為300 g·L－1時，花粉萌發率僅為2.41%，顯著低于對照萌發率（13.60%）。可見高質量濃度的PEG-4000抑制長花玉蘭花粉萌發。丹馨玉蘭花粉在PEG-4000質量濃度為150～250 g·L－1時，萌發率差異不顯著（P＞0.05）， 顯著高于其他處理（P＜0.05）；質量濃度為 200 g·L－1時萌發率最大，為 17.29%； 300 g·L－1PEG-4000抑制花粉萌發，萌發率僅為2.41%，且低于對照（4.39%）。在150g·L－1PEG-4000培養液中黃山木蘭花粉萌發率達最大（42.39%），顯著高于其他質量濃度下花粉萌發率，隨著質量濃度增大，萌發率呈逐漸遞減趨勢。

圖1 不同因素對4種木蘭屬植物花粉萌發率的影響Figure1 Effects of different factors on pollen germination rate of four Magnolia species

2.2 4種木蘭屬植物花粉最佳萌發培養基的選擇

在單因子試驗的基礎上，進行L9（33）正交試驗，尋找最佳培養基組合。試驗結果表明（表1）：4種木蘭屬植物花粉萌發對液體培養基組分的質量濃度存在差異，這可能因不同基因型花粉自身的萌發特性而異。 望春玉蘭在 50 g·L－1蔗糖＋50 mg·L－1硼酸＋200 g·L－1PEG-4000 培養基下萌發率高于其他培養基，高達69.23%，極差分析表明各因素對其花粉萌發率的影響依次為：硼酸＞蔗糖＞PEG-4000。長花玉蘭在 100 g·L－1蔗糖＋200 mg·L－1硼酸＋200 g·L－1PEG-4000 培養基下萌發率最高， 為 51.47%， 極差分析顯示對其花粉萌發率的影響因素依次為：蔗糖＞PEG-4000＞硼酸。丹馨玉蘭在100 g·L－1蔗糖＋100 mg·L－1硼酸＋150 g·L－1PEG-4000培養基下萌發率最高，為29.79%，極差分析顯示對其花粉萌發率的影響因素依次為： 蔗糖＞硼酸＞PEG-4000。 黃山木蘭在 50 g·L－1蔗糖＋100 mg·L－1硼酸＋250 g·L－1PEG-4000 培養基下萌發率最高，為69.54%，極差分析表明各因素對其花粉萌發率的影響依次為蔗糖＞硼酸＞PEG-4000。

表1 4種木蘭屬植物花粉正交試驗的萌發率Table 1 Pollen germination rate of four Magnolia species in orthogonal design experiment

2.3 4種木蘭屬植物花粉萌發最適條件

2.3.1 最適培養溫度 不同溫度對望春玉蘭、長花玉蘭、丹馨玉蘭及黃山木蘭花粉萌發率均有一定的影響（圖3A）。15～25℃內，隨著溫度的升高，萌發率隨之增加，25℃時各植物花粉萌發率顯著高于其他溫度處理萌發率（P＜0.05），依次為75.85%，31.85%，18.94%，61.14%；在25～35℃內，隨著溫度的上升，萌發率受到抑制，即溫度過高或過低均不適合4種花粉萌發。由此可見：雖然4種不同遺傳背景的花粉萌發率有較大差異，但其最適萌發溫度相同。

2.3.2 最適培養時間 由試驗結果可知（圖3B）：培養3 h時，4種木蘭屬植物花粉均已萌發，6～9 h萌發率迅速上升，12～15 h萌發率趨于穩定。其中培養9 h時，望春玉蘭和黃山木蘭花粉萌發率達到最大，分別為71.19%和59.82%，而長花玉蘭和丹馨玉蘭花粉萌發率在培養12 h時達到最大，分別為44.50%，23.43%。4種植物花粉雖最適培養時間有所不同，但其萌發趨勢幾乎一致。

圖2 不同培養條件下4種木蘭屬植物花粉萌發率的變化Figure 2 Changes of different culture conditions on pollen germination rate of four Magnolia species

3 結論與討論

蔗糖和硼酸是組成花粉離體培養基的基本成分，蔗糖為花粉代謝、跨膜運輸等過程提供必要的能量，同時也是維持花粉內環境穩定的滲透調節物質［12］。本研究結果表明，蔗糖對4種木蘭屬植物花粉萌發的影響水平不同，蔗糖在長花玉蘭、丹馨玉蘭及黃山木蘭花粉萌發中具有主導作用，但對望春玉蘭花粉萌發率影響水平次于硼酸，這可能與不同植物生物學特性相關。4種木蘭屬植物花粉萌發最適蔗糖質量濃度（50～100 g·L－1）與二喬玉蘭［8］， 天女木蘭［9］結果相符。

硼元素在植物體內作為微量營養生長調節劑，以花器官內含量居多，且主要分布于柱頭及子房，硼對糖分的吸收具有促進作用，參與果膠物質的合成，且促進花粉管壁的形成，從而加快花粉萌發生長［13］。本研究中，4種木蘭屬植物所需最適硼酸質量濃度不同，但在含有硼酸的培養基中花粉萌發率均高于對照，即花粉萌發需要硼元素的參與。正交試驗結果表明：望春玉蘭花粉萌發所需硼酸質量濃度低于其他3種花粉，可能由于蔗糖和PEG-4000的添加，望春玉蘭花粉對硼酸的需求量減少。長花玉蘭在200 mg·L－1硼酸溶液中萌發率達最大，與景寧木蘭研究結果相同［11］；丹馨玉蘭、黃山木蘭均在100 mg·L－1硼酸溶液中萌發率達最大，與二喬玉蘭、天女木蘭結果一致［8－9］。由此可知：100～200 mg·L－1硼酸可促進木蘭屬植物花粉萌發生長。

PEG-4000作為高分子滲透劑，在花粉萌發過程中，通常改變花粉內膜結構，提高內膜通透性，從而促進花粉粒萌發［14］。單因素試驗表明：4種木蘭屬植物最適PEG-4000質量濃度為150～250 g·L－1，對蠟梅Chimonanthus praecox［15］的研究發現，低質量濃度PEG-4000對花粉離體萌發作用不顯著，而高濃度下，花粉萌發率顯著受到抑制，本研究結果與此相一致。正交試驗結果表明：PEG-4000在4種花粉萌發中均不是主導因子，而若蠟梅花粉離體培養基內不含PEG-4000，其花粉不萌發［15］，可能由于不同科植物花粉萌發過程中所需營養不同。PEG-4000是首次應用于木蘭屬植物花粉離體萌發，對同屬其他植物花粉萌發有待進一步研究。

多數花粉萌發的最適溫度為25℃［16］，本研究結果與此相同。也有研究發現［17］：由于植物分布區不同，其花粉萌發對溫度的響應有所差異。望春玉蘭和黃山木蘭花粉在培養9 h時萌發率達最大，而長花玉蘭和丹馨玉蘭花粉最佳培養時間為12 h，在各自最適培養時間下，對花粉其進行觀察，花粉管互不交錯，清晰，便于統計。

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