一株拮抗放線菌菌株的篩選與鑒定

郭春燕 王旭正 劉少杰 于金鳳

摘要：采用平板對峙法與灰色關聯度分析法從小麥和蘋果根際土壤中篩選出對小麥紋枯病（Rhizoctonia cerealis）和小麥根腐病（Bipolaris sorokiniana）具有良好拮抗作用的放線菌，并依據菌落形態和培養特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析等進行鑒定。結果表明，菌株FX-H-51抑菌效果顯著，對不利生長環境有良好的耐受性。形態學與分子鑒定結果表明，菌株FX-H-51為海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis）。

關鍵詞：放線菌；灰色關聯度分析；拮抗活性；海棠鏈霉菌

中圖分類號：S154.3文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0043-05

Abstract Actinomycetes with strong antagonistic activity against Rhizoctonia cerealis and Bipolaris sorokiniana were screened out from wheat and apple rhizosphere soil by plate confrontation method and grey correlation degree analysis. They were identified according to the colony morphology and culture characteristics， physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence. The results showed that the FX-H-51 strain had significant antibacterial effect and better tolerance to the unfavorable growth environment. The morphological and molecular identification results indicated that the FX-H-51 strain was to Streptomyces spectabilis.

Keywords Actinomyces； Grey relational degree analysis； Antagonistic activity； Streptomyces spectabilis

放線菌是陸生性較強的原核生物，同時也是一類具有重要經濟價值和生物研究價值的微生物資源，其中鏈霉菌屬（Steptomyces）的放線菌在植物病害生物防治中已有較多的研究報道。Coombs等[1]篩選出對小麥全蝕病有顯著防治效果的鏈霉菌菌株；陳杰等[2]從26株供試拮抗放線菌中篩選出對馬鈴薯土傳病原真菌有較強拮抗效果的鏈霉菌菌株。鏈霉菌在自然環境中多見于土壤和海洋水體，其種類豐富多樣，產生的抗生素及其它次生代謝物質在植物病害生物防治方面具有重要作用[3，4]。在已經發現的抗生素中，近60%是由放線菌產生，其中鏈霉菌屬占90%左右[5]。

近年來，小麥土傳病害如紋枯病、根腐病[6，7]等在黃淮海麥區的發生逐年加重，給農業生產帶來了嚴重損失，目前生產上還沒有非常有效的防治方法。利用拮抗微生物防治該類土傳病害具有良好的應用前景。

本研究在前期從土壤中分離得到大量放線菌的基礎上，從中篩選獲得一株對小麥紋枯病菌、根腐病菌表現出較強抑制活性的菌株FX-H-51，并對該菌株進行了鑒定，以期為小麥根莖部病害的綠色防控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：實驗室保存的放線菌菌株116株，分離自陜西、山西、甘肅等地的蘋果園果樹根際重茬土以及山東各地小麥田根際土。用于進行拮抗篩選的病菌：禾谷絲核菌（WK207，Rhizoctonia cerealis）、平臍蠕孢菌（WB112，Bipolaris sorokiniana）、黃色鐮孢菌（WF25，Fusarium culmorum），所用供試病原真菌均由山東農業大學真菌與真菌資源利用實驗室提供。

培養基：菌株篩選、培養用高氏1號培養基，真菌培養及抗菌作用分析用PDA培養基；麥芽糖發酵培養基 。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗放線菌菌株的初篩 采用平板對峙法[8]測定放線菌菌株對3種病原真菌的拮抗作用。25℃培養7 d，每個處理重復3次。觀察各菌株對靶標菌的抑制效果，選取有明顯抑制圈的菌株作為復篩菌株。

1.2.2 拮抗放線菌菌株的抑菌防治效果試驗 將初篩得到的菌株各自及組合的發酵液進行溫室盆栽試驗。取3種病原真菌分別接種在麥粒培養基中，25℃培養7 d，進行擴大繁殖，作為接種體。小麥種子均勻播于盆中，每盆10粒，每粒附近接入1粒接種體，然后用土壤覆蓋。取5 mL發酵液分別均勻加入盆中，以不加發酵液為對照，每個處理重復3次，30 d后統計發病情況。

1.2.3 拮抗放線菌菌株的復篩 利用灰色關聯度分析法對初篩得到的菌株的生防效果及耐性進行綜合評判[9-11]。生防效果以初篩時平板對峙試驗結果作為判定依據。耐性評價主要是菌株對溫度、酸堿性、抗生素的耐受能力，各性狀的評價指標為：耐低溫性是10℃條件下培養6 d后的菌落直徑，耐高溫性是40℃條件下培養6 d后的菌落直徑；耐酸性是pH=3、25℃條件下培養6 d后的菌落直徑；耐堿性是pH=11、25℃條件下培養6 d后的菌落直徑；對鏈霉素的耐性是菌株在含1 mg/L鏈霉素的高氏1號培養基上培養6 d后的菌落直徑。

根據灰色系統理論，將所有供試菌株視為一個灰色系統，每一菌株都是系統中的單一灰因素，選取供試菌株各項性狀最優值作為“參考菌株”各項性狀指標，構成的數列即參考數列X0。而比較數列Xi（i=1，2，3，4）是供試菌株各項性狀指標構成的數列，將X0與Xi進行數據量化處理，求出各供試菌株與參考菌株的關聯度，并按關聯度大小排出關聯序。

1.2.4 菌株鑒定 形態特征觀察及生理生化特征測定參照《鏈霉菌鑒定手冊》[12]和《微生物學實驗手冊》[13]的相關內容；分子生物學鑒定參照徐平等（2003）[14]和姜淑梅等（2007）[15]的相關內容。以27F和ITS4為引物對菌株的16S rDNA進行PCR擴增，對目的基因進行克隆測序，得到菌株的16S rDNA序列。在NCBI數據庫中進行BLAST相似性分析，查詢與菌株相近的16S rDNA序列，利用MEGA4.1軟件構建系統發育樹。

1.3 數據分析

利用DPS軟件對X0與Xi進行數據量化處理，得到4株放線菌菌株與參考菌株的關聯度。

2 結果與分析

2.1 拮抗放線菌菌株的初篩

根據抑菌半徑的大小，初步篩選到對3種病原菌抑菌效果均較好的4個菌株，見表1。

2.2 拮抗放線菌菌株對小麥紋枯病、根腐病的防治效果

圖1表明，菌株FX-H-51對禾谷絲核菌引起的小麥紋枯病的防治效果最好，達到81.20%；菌株FX-S-178對黃色鐮孢菌引起的小麥根腐病防治效果最好，達到76.53%。單個菌株仍是菌株FX-H-51對平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病防治效果最好。兩兩組合的菌株處理表現都不理想。菌株FX-H-51、FX-H-71、FX-S-178組合對平臍蠕孢菌引起的小麥根腐病防治效果最好，達到75.10%。三個菌株組合的處理提高了對蠕孢菌的控制效果，但沒有提高其對黃色鐮孢菌和禾谷絲核菌的控制效果。

2.3 拮抗放線菌菌株的綜合評價

以4株放線菌菌株對峙WK207的抑菌半徑及耐性測定結果為指標構建參考菌株（表2）。

表3表明，菌株FX-H-51的綜合性狀與參考菌株的灰色關聯度值最高，是比較理想的抗病抗逆放線菌菌株。

2.4 菌株FX-H-51的形態學及生理生化鑒定

菌株FX-H-51在高氏1號培養基上菌落生長繁茂，邊緣不規則向四周擴散，呈橙紅色，表面絨狀隆起且干燥不透明。氣絲直桿狀，淺粉色，基絲橙紅色，無橫隔，孢子橢圓形，表面光滑（圖2）。菌株FX-H-51能使明膠全部液化，牛奶凝固且胨化，能夠水解淀粉跟纖維素，但水解纖維素能力較弱，硝酸鹽不還原，不產生硫化氫（圖3）。

2.5 菌株FX-H-51的分子生物學鑒定

對菌株FX-H-51的16S rDNA進行PCR擴增，獲得一條1 447 bp的條帶（圖4），之后克隆測序得到菌株FX-H-51的16S rDNA序列，通過比對分析并構建系統發育樹（圖5）可以看出，菌株FX-H-51與海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis，基因登錄號為KC737552.1）的16S rDNA序列同源性最高，并且在系統發育樹中聚于同一分支中。

根據以上形態特征和生理生化特性，FX-H-51符合鏈霉菌屬的相關特征；進一步由16S rDNA序列測定結果，最終確定該菌株為海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis） 。

3 討論與結論

灰色關聯度分析法是對目標性狀進行綜合描述和量化評估的一種有效方法，能夠全面、客觀地評價每個菌株的表現，克服了方差分析或回歸分析等方法中僅考慮抑制率一個因素而使某些綜合性狀較好的菌株被埋沒的弊端。本研究利用灰色關聯度分析法，對4株抑菌效果較好的放線菌菌株進行了綜合評價，這將為篩選高效生防菌株提供借鑒。

小麥土傳病害是嚴重影響小麥產量的根部病害，化學防治是目前農業生產上最主要的防治方法。放線菌資源豐富，近年來在農業生產中已有越來越多的應用，尤其是鏈霉菌在生物防治方面也有大量發現和報道。魏曉麗等[16]從青藏高原分離得到的4株放線菌均能明顯提高棉花幼苗整株和根系鮮重。Evangelista-Martinez等[17]從土壤中分離了一株放線菌，其對黑曲霉、長蠕孢菌等的抑菌率為47%～90%。申屠旭萍等[18]對淀粉酶產色鏈霉菌進行研究表明，其代謝產物豐加霉素對黃瓜枯萎病、菜豆炭疽病、番茄灰霉病等致病菌有很好的拮抗作用。目前利用鏈霉菌防治小麥土傳病害的報道相對較少。本研究從116株放線菌中篩選出一株具有較好耐受性的高效生防放線菌FX-H-51，根據形態特征、生理生化特性和16S rDNA序列測定結果，確定該菌株為海棠鏈霉菌（Streptomyces spectabilis） 。放線菌菌株FX-H-51對小麥紋枯病及根腐病的生防效果較好，具有良好的開發潛力，為進一步應用到農業生產奠定了基礎。

參 考 文 獻：

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