生防解淀粉芽孢桿菌Bs—18 TnYLB—1突變體文庫的構建

孫淑琴 孫冰冰 楊秀榮 張惟 霍建飛

摘要：解淀粉芽孢桿菌Bs-18是一株對黃瓜白粉病具有顯著防效的生防菌株，為深入研究此菌株的生防作用機理，本研究應用電擊法構建了攜帶轉座子TnYLB-1的穿梭質粒pMarA轉化Bs-18的突變體文庫。通過對轉座溫度和轉座時間的篩選，篩選出50℃高溫誘導16 h可獲得最大轉座成功率，并對突變體進行了PCR驗證。Bs-18突變體文庫的構建為研究其生防功能基因并深入揭示其生防作用機制奠定了基礎。

關鍵詞：突變體文庫；轉座子；生防功能基因

中圖分類號：S476.1+Q785文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2018）04-0012-04

Abstract Bacillus amyloliquefaciens Bs-18 is a biocontrol strains against cucumber powdery mildew with significant control effect. In this paper， the mutant library of Bs-18 was constructed with the shuttle plasmid pMarA carrying transposon TnYLB-1 by the electric shock method to deeply study the molecular mechanism of the biocontrol strain. Through screening transpositional temperature and time， the maximum transpositional success rate was obtained after induced at 50℃ for 16 hours. The mutants were verified by PCR. The construction of Bs-18 mutant library laid a foundation for further study on its biocontrol function genes and mechanism.

Keywords Mutant library； Transposon； Biocontrol function genes

隨著許多微生物基因組全序列的獲得，人們對微生物關注和研究的熱點逐漸從結構基因組學轉移到功能基因組學上。轉座子隨機突變技術因操作簡單逐漸成為研究功能基因組（如發現新基因、克隆功能基因、發掘已知基因的新功能）的一種有效工具。目前利用轉座子隨機突變技術對于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的研究較為深入，并且獲得了與芽孢形成、生物被膜形成以及植物與微生物互作等相關基因[1，2]。隨著對轉座子技術研究的深入，解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）在這一領域的工作也逐漸展開。郝建安等[3]通過對解淀粉芽孢桿菌Mu轉座突變子進行表型篩選，并結合克隆和測序發現了2個新的抑菌作用調節基因rpmGA和yxlC。高衛華等[4]對1株野生型解淀粉芽孢桿菌進行了mini-Tn10 轉座突變庫的構建，根據菌落形態差異進行初篩，利用結晶紫染色法篩選生物被膜缺陷菌株，由此發現了芽孢桿菌生物被膜形成相關基因。從突變庫中篩選到4株生物被膜缺陷株，經過鑒定發現突變株citB、citG、gpsA和yvfB基因發生插入突變，其中citB、citG 和gpsA均與能量代謝相關，yvfB基因功能未知。由此可見，轉座突變技術已成為發現功能基因的一種有效手段。穿梭質粒載體 pMarA 上攜帶轉座子 TnYLB-1，它具有轉座頻率高、插入穩定、隨機插入、非寄主專化性等優點，已成為人們研究細菌基因功能的首選轉座子。

Bs-18是本實驗室分離自黃瓜根系的微生物，大田防治試驗表明其對黃瓜白粉病的防效達79%，經生理生化和分子鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。本研究以攜帶轉座子TnYLB-1的質粒pMarA為插入質粒，通過電擊法轉化野生生防菌株Bs-18，篩選高溫誘導轉座的最佳溫度和時間，從而構建Bs-18的轉座插入突變體文庫，為研究其生防功能基因及深刻揭示生防解淀粉芽孢桿菌的生防作用機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 菌株Bs-18（B. amyloliquefaciens Bs-18）由本實驗室分離保存。質粒pMarA購自BGSC中心。

1.1.2 引物 本試驗引物合成和序列測定均由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.1.3 試劑 DL2000、MIX等分子試劑購自天根生化科技（北京）有限公司；卡那霉素（Kan）、紅霉素（Erm）購自上海生工生物工程有限公司；蛋白胨、牛肉浸膏等其它試劑均為國產分析純。

1.2 質粒轉化生防解淀粉芽孢桿菌Bs-18

1.2.1 質粒pMarA轉化Bs-18菌株 挑取單菌落Bs-18接種于5 mL試管中，37℃、160 r/min搖床過夜培養。將培養液按1%接種量接種于20 mL LB液體培養基中，搖床培養至OD600為0.65左右。將培養好的菌液冰浴20 min。4℃、8 000 r/min離心2 min，收集菌體。加入10 mL預冷的 ddH2O清洗菌體細胞3次。再加入ddH2O重懸菌體，制得感受態細胞。在100 μL感受態細胞中加入1 μL質粒pMarA，均勻混合，將混合物移至預冷的電擊杯中，以1.1 kV電壓，電穿孔儀BIO-RAD進行脈沖電擊（電阻200 Ω，電容25 μF），電擊后迅速加入400 μL復蘇培養基，37℃溫浴60 min，涂布含Kan（50 μg/mL）和Erm（10 μg/mL）的雙抗平板，37℃培養過夜，第二天挑取平板上的轉化子Bs18-MA[5-7]。

1.2.2 轉化子的驗證 從轉化平板上挑選轉化子，接種于含Kan（50 μg/mL）的LB液體培養基中，使用離心柱型質粒小提試劑盒提取轉化子質粒。

使用引物oAtnpFwd、oAtnpRev擴增轉化子中的HimarⅠ轉座酶編碼基因片段。

使用引物Km-F和Km-R擴增轉化子中的卡那霉素抗性基因片段。

以上驗證均以質粒pMarA作為陽性對照，以Wt作為陰性對照，擴增程序為：96℃ 2 min；94℃ 45 s，62℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever[8]。

1.3 高溫誘導轉座子TnYLB-1轉座

1.3.1 轉座子TnYLB-1轉座條件的優化 挑取轉化子于LB（Kan 50 μg/mL，Erm 10 μg/mL）液體培養基中，37℃、160 r/min振蕩培養24 h。將菌液系列稀釋至10-3～10-6，取100 μL涂布LB （Kan 50 μg/mL）平板，將平板置于不同溫度條件下（分別設45、46、47、48、49、50℃溫度梯度），分別處理不同時間（4、10、16、22 h）。用無菌牙簽挑取LB平板上的同一單菌落分別點種于Erm和Kan抗性平板上，進行原位生長比較試驗。具有Kan抗性而缺失Erm抗性的菌株即為TnYLB-1轉座插入Bs-18菌株基因組的突變子，挑取突變子構建菌株Bs-18的突變體文庫[9]。

轉座成功率（%）=（K-E）/K×100

式中K∶代表卡那霉素平板上的菌落數，E∶代表紅霉素平板上的菌落數。

1.3.2 突變體的驗證 從Bs-18的突變體文庫中隨機挑取12個突變體，提取基因組DNA，用引物oITR 擴增突變體基因組的TnYLB-1轉座子片段，驗證TnYLB-1轉座子片段是否成功插入到Bs-18的基因組中。以質粒pMarA作為陽性對照，以Wt作為陰性對照，擴增程序為：96℃ 2 min；94℃ 45 s，66℃ 1 min，72℃ 2 min，30 cycles；72℃ 10 min；4℃ forever。

2 結果與分析

2.1 Bs-18的轉化

將攜帶TnYLB-1轉座子的穿梭質粒pMarA轉化入解淀粉芽孢桿菌Bs-18的感受態細胞中，獲得數個轉化子Bs18-MA。使用離心柱型質粒小提試劑盒提取轉化子質粒。通過引物oAtnpFwd-oAtnpRev擴增質粒中的HimarⅠ轉座酶編碼基因（如圖1A），待驗證轉化子4—6均得到約為1.5 kb的片段，與質粒pMarA得到的片段一致，而Wt沒有擴增出條帶。又通過引物Km-F、Km-R擴增質粒中的卡那霉素抗性基因（如圖1B），

待驗證轉化子2—4得到了與質粒pMarA一致的片段，而Wt沒有擴增出此條帶。以上驗證結果表明，質粒pMarA已經成功轉入到菌株Bs-18中，轉化子Bs18-MA可以用于后續試驗。

2.2 高溫誘導轉座子TnYLB-1的轉座

由于質粒pMarA含有溫度敏感型復制子repG+ts，30℃時在菌體中能復制，而50℃不能復制，在50℃下，質粒上的HimarⅠ在啟動子PA作用下表達，并識別轉座子TnYLB-1兩端的反向重復序列ITR，使轉座子從質粒上跳躍到宿主菌基因組上，并識別基因組上的插入位點“TA”，隨機插入宿主基因組。在轉座子發生轉座后，其余的質粒骨架（含ErmR）將在細胞中被降解，因此在LBKan平板上生長而在LBErm平板上不生長的菌落即為成功發生轉座的突變子。原位生長比較試驗中隨機挑選2 000株目標突變子，構建菌株Bs-18的TnYLB-1突變體文庫。

通過菌液濃度系列稀釋表明稀釋濃度為10-5時，菌落在LB平板中能夠較好的以單菌落形式生長，后續試驗均采用10-5濃度涂板。通過比較不同轉座溫度及轉座處理時間對轉座成功率的影響發現，如圖2所示，在同一溫度誘導下，隨誘導時間的延長而逐漸升高，16 h處理的轉座成功率最高，之后轉座成功率又呈現降低的趨勢；同一誘導時間不同誘導溫度下，50℃處理誘導轉座成功率最高，其次為49℃。表明轉座子TnYLB-1在50℃高溫誘導處理16 h后能最大效率地（高達70%）轉座菌株Bs-18。

2.3 突變體的驗證

擴增結果顯示，12個隨機挑選的突變體基因組中都能擴增出與質粒pMarA中的TnYLB-1轉座子片段大小相同的片段，與陽性對照質粒pMarA的擴增結果一致，而野生型菌株Bs-18不能擴增出該片段（圖3），說明TnYLB-1已成功插入到Bs-18基因組中。

3 討論與結論

轉座子（transposon，Tn）又稱轉座因子或跳躍因子，是存在于染色體DNA上可自主復制和移位的DNA片段，于20世紀50年代初由McClintock在玉米基因組中首次發現。當轉座子在基因組間或組內跳躍而插入到某個基因時，就可能引起插入處基因發生突變或使鄰近插入處基因的表達活性發生改變。本研究利用穿梭質粒pMarA上的轉座子TnYLB-1轉化B. amyloliquefaciens Bs-18，構建了含2 000株菌株的突變體文庫，為更好地揭示生防菌株Bs-18的生防功能基因奠定了基礎。

本研究利用電擊法將質粒pMarA轉化Bs-18菌株的轉化效率很低，分析原因一可能是由于質粒pMarA過大，增加了轉化的難度；二可能是由于B. amyloliquefaciens Bs-18的感受態細胞制備困難，今后還應在芽孢桿菌的感受態細胞制備方面做更深一步的研究，為提高轉化效率奠定基礎。本試驗轉化成功的轉化子Bs18-MA成為后續試驗轉座子TnYLB-1隨機插入Bs-18基因組的重要前提和基礎。

本試驗通過誘導條件篩選，表明轉座子TnYLB-1隨機插入解淀粉芽孢桿菌Bs-18基因組的最佳溫度是50℃，最佳誘導時間為16 h。有研究表明，轉座子TnYLB-1的轉座效率在10-2數量級，而在本研究中，沒有采用轉座效率，而是采用轉座成功率。因為經高溫誘導轉座后在LBKan上生長的菌落并不一定是轉座成功的突變體，必須進行原位生長比較試驗才能最終得到正確的突變體，即經高溫誘導后，在含Kan抗性平板上生長而在含Erm的抗性平板上不能生長的菌落數占在含Kan抗性平板上生長的菌落數的百分比。轉座成功率的表示方法簡單，省去了換算過程，能更直觀地表明轉座成功與否。誘導條件的篩選為快速建立突變體庫節省了大量的時間和精力，也為后續突變體的篩選提供了大量的試驗材料。

參 考 文 獻：

[1] Budiharjo A，Chowdhury S P， Dietel K， et al. Transposon mutagenesis of the plant-associated Bacillus amyloliquefaciens ssp. plantarum FZB42 revealed that the nfrA and RBAM17410 genes are involved in plant-microbe-interactions[J]. PLoS One，2014，9（5）：e98267.

[2] Le Breton Y， Mohapatra N P， Haldenwang W G. In vivo random mutagenesis of Bacillus subtilis by use of TnYLB-1， a mariner-based transposon[J]. Applied and Environmental Microbiology，2006，72（1）：327-333.

[3] 郝建安，曹志輝，徐海津，等.利用人工Mu轉座技術研究解淀粉芽孢桿菌的功能基因[J].生物技術通訊，2006，17（3）：311-313.

[4] 高衛華，郝建安，夏思源，等.利用mini-Tn10轉座系統研究芽孢桿菌生物被膜形成相關基因[J].微生物學報，2009，36（3）：345-349.

[5] 范海燕，汝津江，高坦坦，等.枯草芽胞桿菌9407TnYLB-1轉座子突變體庫的構建[J].中國科技論文，2016，11（18）：2082-2086.

[6] 陳永軒，王娜娜，高小寧，等.用轉座子TnYLB-1構建枯草芽孢桿菌EDR4突變體庫[J].西北農業學報，2014，23（11）：123-129.

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[8] 馬欣，劉俊，喬俊卿，等.利用轉座子TnYLB-1構建枯草芽孢桿菌的突變體文庫[J].南京農業大學學報，2011，34（6）：77-81.

[9] 彭玲.植物內生生防蠟樣芽孢桿菌0-9菌株轉座子插入突變體庫的建立及評價[D].開封：河南大學，2011.