TTC染色指數配合Logistic方程鑒定山葡萄種質抗寒性

趙 瀅，艾 軍，楊義明，王振興，劉迎雪，何 偉，劉海雙

（中國農業科學院特產研究所，長春 130112）

0 引 言

山葡萄（Vitis amurensis Rupr.）屬多年生木質藤本，是葡萄屬中最抗寒的一個種[1-2]。休眠期枝條的抗寒性具有較高的遺傳力，是葡萄抗寒育種的重要親本材料[3-4]。但田間觀察發現不同山葡萄種質抗寒能力存在差異，而目前適于山葡萄休眠期枝條抗寒性的鑒定方法尚不夠完善，對不同山葡萄種質資源抗寒差異的了解仍不清晰[5]，影響了抗寒種質的進一步發掘與利用。

低溫半致死溫度（LT50）可用來反映植物的抗寒性，實驗室常用相對電導率法擬合計算低溫半致死溫度來鑒定葡萄屬的抗寒性[6-7]。然而，在實際測定中發現由于溫度、浸泡時間以及空氣中 CO2的溶解等因素都會對實際測定的電導值產生影響，造成測定結果重復性較差[8-10]。而采用隸屬函數法對作物抗寒性進行綜合評價的結果較為全面、準確[11-14]，但對于大量種質抗寒性的篩選則需要尋找更為簡便且準確的鑒定方法。

2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法也可用于作物抗寒性鑒定[15-18]，具有直觀且操作簡便等優點，但目前關于TTC染色法測定枝條組織活力的研究報道中，均是通過觀察枝條橫截面剪口著色深淺程度進行判定[19]。在實際操作中發現該方法存在一些不足，主要是染色生成紅色的三苯基甲臢（TTF）經常在失去組織活性的枝條橫截面剪口外側堆積，造成觀測誤差；另外，枝條橫切面著色深淺程度目測也難以準確判斷，需量化。

本研究將以40份山葡萄種質1 a生休眠期枝條為試材，對浸染枝段進行縱切，以枝段縱切面染色面積為判斷標準，可避開原有TTC染色法橫截面上出現TTF堆積問題；同時探索TTC染色圖像的可視化評估，以及量化獲得的染色指數能否配合 Logistic方程在山葡萄抗寒性鑒定上進行應用，并與隸屬函數法獲得的綜合抗寒性評價結果及田間鑒定結果進行比較，以此來驗證這種以枝段縱切面染色面積為判定標準的抗寒性鑒定新方法的可行性和準確性，以期建立起適于大量山葡萄種質休眠期抗寒性鑒定的簡便、可靠方法，從而判斷不同山葡萄種質抗寒性強弱，最終為山葡萄抗寒評價研究及抗寒育種材料選擇提供有效鑒定方法和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料采自國家果樹種質左家山葡萄圃，種質圃地處吉林省吉林市左家鎮，位于北緯 44°04′，東經 126°05′，海拔190 m。年均氣溫3.6 ℃，絕對低溫-39.8 ℃。圃地為南向緩坡地，土壤為暗棕森林土。圃中每份資源為扦插繁殖的自根苗，籬架生長，株行距1.0 m × 2.5 m，柱間距6 m。樹體肥水管理采用常規管理模式[20]。40份試材包括純種山葡萄種質（V. amurensis）38份，山歐雜種（（V.amurensis×V.vinifera）×V.amurensis）2 份。38 份山葡萄種質的休眠期枝條于2017年1月剪取，當年1月最低氣溫為-28.2 ℃；山歐雜種‘北冰紅’和‘左優紅’為對照品種，其休眠枝條于深秋10月底未埋土防寒前剪取，然后放入冷庫中待處理。所用枝條均為長勢和粗度相對一致（約0.8 cm粗）且健康成熟的1年生枝條，架面南側1.0～1.8 m范圍內取樣。每份種質取50根枝條，每根60 cm長。

1.2 材料處理

材料處理參照 Zhang等的方法[21]，略有修改。將采集的枝條帶回實驗室，剪成20 cm長的小段，裝于自封袋中，-15 ℃冰箱中貯藏。使用高低溫交變試驗箱（型號：GDJW-225，北京雅士林試驗設備有限公司）對枝條進行低溫處理，處理溫度為-20、-25、-30、-35、-40、-45、-50 ℃，按4.0 ℃/h的速度降溫，至設定溫度后保持12 h，再按4.0 ℃/h的速度升至20 ℃后，取出靜置2 h。去除表皮，避開芽眼，以備用于抗寒性評價及指標測定等研究。

1.3 抗寒性的實驗室鑒定

1.3.1 TTC染色圖像可視化評估鑒定枝條抗寒性

不同低溫處理后，從各枝條上剪取0.5 cm小段，每份種質取10段，放入10 mL 0.5 % TTC染液中，于30 ℃恒溫培養箱中避光染色4 d后取出，然后將枝段縱切，蒸餾水沖洗 3次，濾紙吸干水分，放入連有 WinRHIZOTM圖像分析軟件的 LA2400掃描儀中對枝段縱切面進行掃描；利用圖像分析軟件計算縱切面染色面積并確定染色等級；同時根據染色等級計算染色指數，以染色指數反映各試材的受凍程度。

染色分級標準如下（圖1）：4級，縱切面90 %以上的面積呈紅色；3級，縱切面70%～90%的面積呈紅色；2級，縱切面40%～70%的面積呈紅色；1級，縱切面5%～40%的面積呈紅色；0級，縱切面5%以下的面積呈紅色。染色指數= Σ（染色級別×枝段數）/（4×枝段總數）。

圖1 染色分級標準Fig.1 Standard of staining identification

根據不同山葡萄種質各低溫處理下枝段染色指數的變化情況，配合 Logistic方程建立回歸方程，擬合溫度拐點來確定其低溫半致死溫度（LT50），具體參照解越等方法[22]。

1.3.2 隸屬函數法綜合評價枝條抗寒性

采用隸屬函數法對山葡萄種質抗寒性進行綜合評價。根據最適冷凍溫度下枝條 7項抗寒指標（包括相對電導率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白、萌枝率、凍害指數）的平均隸屬度值將山葡萄種質抗寒性分為5個級別，分級標準參照張劍俠等的方法[5]，Ⅴ級，平均隸屬度值＞ 0.70～1.00；Ⅳ級＞ 0.60～0.70；Ⅲ級＞0.40～0.60；Ⅱ級＞ 0.30～0.40；Ⅰ級 0～0.30。

1） 生理指標測定

相對電導率測定參照 Verslues等[23]的方法。丙二醛含量測定采用硫代巴比妥酸法[24]；脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法[25]；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[26]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍G-250染色法[27]。

2） 水培萌枝率調查

每份試材選取帶芽眼的枝段共30根，10根為1次重復，共 3次重復。經-35 ℃最適冷凍溫度處理（處理方法同1.2）后插入水中，1個月后調查水培萌枝率，參照Nanami等[28]方法。培養期間每 5 d換一次水。萌枝率=萌芽枝數/總枝數×100 %。

3） 凍害指數調查

枝段經最適冷凍溫度處理后，觀察橫切面組織在低溫處理后的褐變情況來確定凍害級別，凍害級別及冷害指數計算參照呂中偉等的方法[29]。

1.4 抗寒性的田間鑒定

通過調查每份試材的田間萌芽率來對其田間抗寒性進行鑒定。田間萌芽率調查參照劉崇懷等[30]方法，本試驗于2017年5月初調查每份試材在資源圃中經自然越冬后的萌芽情況，統計萌芽率。萌芽率=單株芽眼萌芽數/單株總芽眼數×100%。

1.5 數據統計分析

采用SAS9.0軟件對數據進行方程及相關性分析，利用 Duncan多重比較進行檢驗；作圖采用 Sigmaplot10.0軟件。

2 結果與分析

2.1 TTC染色圖像可視化評估鑒定山葡萄種質抗寒性

山葡萄經不同低溫處理后染色指數與冷凍溫度呈典型的倒‘S’型曲線，說明可以利用非線性回歸分析結合Logistic方程擬合溫度拐點，確定低溫半致死溫度（LT50）；低溫半致死溫度越低，抗寒性越強[31]，‘雙優’和‘北冰紅’低溫半致死溫度分別為-38.63和-29.75 ℃（表1），可見 2個品種抗寒性差異明顯；圖像可視化評估所求得的染色指數也能將‘雙優’和‘北冰紅’的抗寒性有效分開（圖2a）；同時不同低溫處理下枝條的水培萌芽情況與2個品種抗寒能力相符（圖2b；表2）。說明TTC染色圖像可視化評估配合 Logistic方程鑒定山葡萄種質抗寒性具有一定的可行性，40份山葡萄種質抗寒性鑒定結果詳見表1。

表1 40份山葡萄種質抗寒性鑒定結果Table 1 Identification of cold resistance in 40 V. amurensis germplasms

表2 低溫處理下2個山葡萄品種枝條水培萌枝率Table 2 Shoots sprout rate of in two varieties of V. amurensis in hydroponic culture under cold temperatures %

通過對表1中同一溫度下40份山葡萄種質的染色指數與其低溫半致死溫度的相關性分析表明，-20、-25、-30、-35和-40 ℃處理下的枝段染色指數與其低溫半致死溫度之間均呈極顯著（P＜0.000 1）負相關，其中-20 ℃下，相關系數r=-0.632 55，P＜0.000 1；-25 ℃下，r=-0.791 16，P＜0.000 1；-30 ℃下，r=-0.832 20，P＜0.000 1；-35 ℃下，r=-0.861 38，P＜0.000 1；-40 ℃下，r=-0.726 03，P＜0.000 1。可見兩者在-35 ℃下的相關性最強，因此本研究將-35 ℃作為最適冷凍溫度，進一步利用隸屬函數法對最適冷凍溫度下40山葡萄種質枝條的抗寒性進行綜合評價。

圖2 染色指數及水培萌枝率在冷凍溫度下的變化Fig.2 Change of staining index and hydroponic culture sprout rate under cold temperatures

2.2 隸屬函數法綜合評價山葡萄種質的抗寒性

枝條經-35 ℃最適冷凍溫度處理后，對40份山葡萄種質抗寒指標進行相關性分析結果表明，指標變量間存在一定的相關性（表 3），說明多個指標提供的抗寒信息有交叉重疊現象，進一步利用主成分分析對所測指標進行綜合評價。

表3 最適冷凍溫度下山葡萄種質抗寒性指標的相關性分析Table 3 Correlation analysis of cold resistance indexes in V.amurensis germplasms under optimum freezing temperature

以累計貢獻率大于85%為原則選擇主成分，其中第1主成分中特征向量絕對值較大的是相對電導率、丙二醛及可溶性蛋白含量，貢獻率達41.48%；第2主成分則是萌枝率和凍害指數，貢獻率達25.70%；第3主成分中可溶性糖含量特征向量絕對值較大，貢獻率為15.53%；第4主成分的游離脯氨酸含量特征向量絕對值較大，貢獻率為10.90%。4個獨立主成分的累計貢獻率為93.61%（表4），利用隸屬函數法對以上指標進行綜合分析，以評價山葡萄種質的綜合抗寒性。

表4 抗寒指標主成分分析Table 4 Principal components analysis for cold resistance indexes

依據平均隸屬度值將40份山葡萄種質抗寒性分為5個級別，從Ⅴ級到Ⅰ級抗寒性依次降低。其中Ⅴ級抗寒種質1份；Ⅳ級抗寒種質10份；Ⅲ級抗寒種質24份；Ⅱ級抗寒種質3份；Ⅰ級抗寒2份為山歐雜種（表5）。結果表明，40份山葡萄種質抗寒性存在明顯差異。整體來看，純種山葡萄抗寒性 ＞ 山歐雜種（對照）。

表5 隸屬函數法綜合評價山葡萄種質抗寒性Table 5 Comprehensive analysis of cold resistances in V. amurensis germplasms

2.3 田間萌芽率

本試驗連續3 a對40份山葡萄種質自然越冬后枝條的萌芽情況進行了調查，發現同一資源各年份間的田間萌芽率無明顯差異。但由于田間抗寒性鑒定數據的年份要與實驗室抗寒性鑒定數據的年份相對應，所以本試驗田間萌芽率為2017年的調查結果（表6）。圖3為2017年1—5月的氣象數據，最低氣溫出現在1月下旬，最低為-28.2 ℃。經自然越冬后，40份山葡萄種質因抗寒性存在差異，其田間萌芽率也表現出不同（表6）。

2.4 相關性分析

利用SAS相關性分析結果表明，TTC染色圖像可視化評估量化獲得的染色指數配合Logistic方程求得的40份山葡萄種質低溫半致死溫度與其抗寒平均隸屬度、田間萌芽率均呈極顯著負相關（P＜0.000 1），相關系數分別為－0.883 03（圖4a）和－0.876 70（圖4b），說明該方法與隸屬函數法對山葡萄種質抗寒性鑒定結果較為一致；且染色指數擬合計算出的低溫半致死溫度與實際田間萌芽率的線性關系為 y=－5.576 5x–127.36，為驗證模型準確性，另從源圃中隨機選取了15份山葡萄種質，利用該線性關系方程計算出了 15份種質田間萌芽率的理論值（表7），與田間萌芽率的實際值相關性為－0.985 84，說明TTC染色圖像可視化評估配合Logistic方程求得的山葡萄種質低溫半致死溫度能夠反映其在田間的實際抗寒性，且建模模型準確。

表6 山葡萄種質田間萌芽率調查結果Table 6 Investigation on germination rate of V. amurensis germplasms in field

圖3 2017年氣象數據Fig.3 Meteorological data in 2017

圖4 抗寒性鑒定結果的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of results in cold resistances identification

表7 抗寒性數據模型驗證Table 7 Proof of cold resistance data model

3 結 論

1）TTC染色枝段圖像的可視化評估實現了染色面積的準確量化，量化得出的染色指數與冷凍溫度呈典型的倒‘S’型曲線，說明可以利用非線性回歸分析結合Logistic 方程擬合溫度拐點，確定低溫半致死溫度。

2）該方法量化得出的染色指數配合Logistic方程確定的40份山葡萄種質低溫半致死溫度與其抗寒性綜合評價的平均隸屬度值及田間萌芽率值均呈極顯著負相關（P＜0.000 1），相關系數分別為-0.883 03和-0.876 70。

3）染色指數擬合計算出的低溫半致死溫度與實際田間萌芽率的線性關系為y= - 5.576 5 x-127.36。利用該線性關系方程計算了建模數據以外隨機選取的山葡萄種質田間萌芽率的理論值，與田間萌芽率的實際值相關性為-0.985 84，說明TTC染色圖像可視化評估配合Logistic方程求得的山葡萄種質低溫半致死溫度能夠反映其在田間的實際抗寒性。

4）40份山葡萄種質低溫半致死溫度在-39.41～-29.75 ℃范圍內，種質抗寒性存在明顯差異；總體而言，該研究的純種山葡萄低溫半致死溫度的平均值為-37.25 ℃，山歐雜種山葡萄低溫半致死溫度的平均值為-29.81 ℃，可見純種山葡萄的抗寒性強于山歐雜種山葡萄。

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