利用網(wǎng)絡藥理學方法預測金絲桃苷治療動脈粥樣硬化的作用靶點及作用機制△

劉馳，袁宇，趙文婷，胡麗萍

(遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽 110847)

中藥是一個高度復雜的化學物質(zhì)體系，其復雜性表現(xiàn)為化學成分的復雜，以及與人體相互作用關系的復雜。中藥研究者通過多途徑、多靶點、整體調(diào)節(jié)機制探索中藥的藥效作用。但迄今為止，中藥藥效物質(zhì)基礎和作用機制研究尚無根本性突破，原因是缺乏對中藥高度復雜性及系統(tǒng)性進行研究的手段，如何揭示并系統(tǒng)闡明中藥化學物質(zhì)組成與藥效間的復雜關系，是中藥新藥研發(fā)的熱點和關鍵[1]。

網(wǎng)絡藥理學是在系統(tǒng)生物學和多向藥理學快速發(fā)展的基礎上提出的藥物設計新方法和新策略，它基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡的基礎，通過分析基因網(wǎng)絡庫、蛋白網(wǎng)絡庫、疾病網(wǎng)絡庫、藥物網(wǎng)絡庫等現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的信息資料，結合從實驗中獲得的譜圖數(shù)據(jù)，利用專業(yè)網(wǎng)絡分析軟件及算法，系統(tǒng)的、整體的揭示疾病-疾病、疾病表型-靶點蛋白、靶點蛋白-藥物、藥物-藥物之間的聯(lián)系[2]。網(wǎng)絡藥理學的出現(xiàn)為中藥成分-靶點-疾病-機制的研究提供了新的方法。

山楂作為常用中藥材，臨床上應用廣泛，其藥理作用主要包括調(diào)節(jié)血脂、助消化、保肝、降血壓、抗氧化、抗腫瘤等[3]。有實驗證明，山楂的降血脂作用顯著，并對動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)有治療作用[4-5]。然而山楂(果肉、核及葉)所含化學成分較多，目前為止從山楂中發(fā)現(xiàn)且分離得到的物質(zhì)有150多種，包括黃酮及其苷、有機酸、黃烷及其聚合物等[6]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，山楂黃酮是降血脂的主要成分，而金絲桃苷(Hyperin，Hyperoside，Hyp)是山楂黃酮的主要組分之一，可能對于治療高血脂癥，阻止血管動脈粥樣硬化的形成具有重要的意義[7]。

目前，對Hyp治療AS的作用靶點及其分子機制相關研究較少，需要進一步挖掘和整合，因此本文利用網(wǎng)絡藥理學方法構建“成分-靶點-疾病-通路”相互作用關系網(wǎng)絡，預測Hyp治療AS的作用靶點及其作用機制，為后續(xù)實驗提供參考性依據(jù)。

1 材料

TCMSP數(shù)據(jù)庫(http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php)；Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)；GAD數(shù)據(jù)庫(https：//geneticassociationdb.nih.gov/)；DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)；Cytoscape-v3.2.1。

2 方法

2.1 Hyp相關靶點預測

TCMSP數(shù)據(jù)庫是西北農(nóng)林科技大學研究開發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫和分析平臺，該數(shù)據(jù)庫包含499味草藥以及每味草藥的化合物成分，針對每個化合物提供了較全面的人體吸收、分布、代謝和排泄性質(zhì)評價數(shù)據(jù)，同時提供了潛在活性分子的靶點及疾病信息，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢Hyp作用靶點，檢索得到Hyp相關靶點蛋白名稱。全球蛋白質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫Uniprot是一個集中收錄蛋白質(zhì)資源并能與其他資源相互聯(lián)系的數(shù)據(jù)庫，也是收錄蛋白質(zhì)序列目錄最廣泛、功能注釋最全面的一個數(shù)據(jù)庫，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫將靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)換成相對應的基因名稱并去除非人源的靶點基因名稱，為后期PPI網(wǎng)絡的拓撲分析做準備。

2.2 AS相關靶點預測

GAD數(shù)據(jù)庫由美國國立衛(wèi)生院開發(fā)和維護，數(shù)據(jù)庫的信息以基因為核心，支持在線查詢某種特定疾病相關的基因或某個基因相關的疾病信息。首先對整個GAD數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進行下載，然后查詢AS作用靶點，剔除重復項后直接得到AS相關靶點基因名稱。

2.3 Hyp靶點蛋白質(zhì)相互作用關系PPI網(wǎng)絡構建

將準備好的Hyp作用靶點的基因名稱導入Cytoscape-v3.2.1軟件，繪制Hyp作用靶點與靶點相關蛋白的相互作用關系網(wǎng)絡圖。具體操作步驟：1)打開Cytoscape-v3.2.1軟件中的Bisogenet插件，將Hyp作用靶點基因名稱導入Input Identifiers。2)參數(shù)設置。導入基因名后可見“Network building options”，“Network building options”下面包括4個按鈕，分別為“Identifiers”、“Data Settings”、“Method”和“Output”。首先，點擊“Identifiers”可見選項“Organism”和“Map Input identifiers list to”，在“Organism”中選擇“Homo sapiens(Human)”，在“Map Input identifiers list to”選擇“Gene identifiers only”。其次，點擊“Data Settings”可見“BioRelation Types”下面“Protein protein Interaction”選項，打開“Protein protein Interaction”后可在“Data Sources”選項下進行數(shù)據(jù)庫選擇，最終選擇“BIOGRID”數(shù)據(jù)庫。最后，“Method”和“Output”按鈕中內(nèi)容為默認選項，可以不做處理。3)點擊Submit進行PPI網(wǎng)絡構建。

2.4 AS靶點蛋白質(zhì)相互作用關系PPI網(wǎng)絡構建

將準備好的AS作用靶點的基因名稱導入Cytoscape-v3.2.1軟件，繪制AS作用靶點與靶點相關的蛋白的相互作用關系網(wǎng)絡圖。具體操作步驟：1)打開Cytoscape-v3.2.1軟件中的Bisogenet插件，將AS作用靶點基因名稱導入Input Identifiers。2)參數(shù)設置。導入基因名后可見“Network building options”，“Network building options”下面包括4個按鈕，分別為“Identifiers”、“Data Settings”、“Method”和“Output”。首先，點擊“Identifiers”可見選項“Organism”和“Map Input identifiers list to”，在“Organism”中選擇“Homo sapiens(Human)”，在“Map Input identifiers list to”選擇“Gene identifiers only”。其次，點擊“Data Settings”可見“BioRelation Types”下面“Protein protein Interaction”選項，打開“Protein protein Interaction”后可在“Data Sources”選項下進行數(shù)據(jù)庫選擇，最終選擇“BIOGRID”數(shù)據(jù)庫。最后，“Method”和“Output”按鈕中內(nèi)容為默認選項，可以不做處理。3)點擊Submit進行PPI網(wǎng)絡構建。

2.5 PPI網(wǎng)絡的拓撲分析和核心靶點的篩選

首先，通過Hyp靶點相互作用關系PPI網(wǎng)絡和AS靶點相互作用關系PPI網(wǎng)絡構建交集網(wǎng)絡。其次，使用Cytoscape-v3.2.1軟件中CytoNCA插件對新建立的交集網(wǎng)絡進行拓撲分析，操作步驟：1)選擇“Tool”后下拉菜單選擇“NetworkAnalyzer”，接著在“NetworkAnalyzer”的子菜單中選擇“Network Analysis”，然后在“Network Analysis”的子菜單中選擇“Analyze Network”。2)除Degree(DC)和Select All Centralities外，勾選其他選項進行分析。3)選擇“File”后下拉菜單選擇“exprot”，接著在“exprot”的子菜單中選擇“table”，在“table”的子菜單中選擇“Export Table”，然后在“Export Table”的子菜單中選擇“Merged Network defaul node”導出拓撲數(shù)據(jù)。4)根據(jù)導出的拓撲數(shù)據(jù)計算Degree的中位數(shù)。最后，用Degree值篩選核心靶點。篩選條件參數(shù)設置：①點擊“Select”按鈕選擇“+”，接著選擇“column fliter”下拉菜單中的“Node：Degree”可以進行Degree值范圍設置。②對Degree值范圍的界定，上限為拓撲數(shù)據(jù)中Degree的最大值，下限為Degree的中位數(shù)的兩倍。

2.6 對核心靶點進行GO注釋分析和KEGG通路分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/)進行GO注釋分析和KEGG通路分析。設置參數(shù)，1)Upload：Step 1-輸入核心靶點基因名稱，Step 2-official genesymbol，Step 3-Gene List，Step 4-Submit List。2)List：Homo sapiens-Select Species。3)Background：Homo sapiens-use。參數(shù)設置完成后得到Gene_Ontology(GO注釋分析)和Pathways(KEGG通路分析)數(shù)據(jù)，根據(jù)得到的數(shù)據(jù)結果進行進一步的篩選，篩選條件符合P<0.05和P<0.01。

3 結果

3.1 Hyp靶點信息及PPI網(wǎng)絡圖

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到Hyp靶點蛋白質(zhì)9個，剔除非人源靶點后最終得到8個靶點蛋白質(zhì)，將8個靶點蛋白名稱轉(zhuǎn)化成8個靶點基因名稱，靶點相關信息見表1。將8個靶點基因名稱導入Cytoscape-v3.2.1軟件，生成Hyp靶點蛋白質(zhì)相互作用關系PPI網(wǎng)絡，結果顯示與Hyp相關的節(jié)點蛋白質(zhì)278個，邊緣蛋白質(zhì)2308個，Hyp的PPI網(wǎng)絡圖見圖1。

表1 金絲桃苷相關靶點信息

3.2 AS靶點信息及PPI網(wǎng)絡圖

通過GAD數(shù)據(jù)庫檢索得到AS靶點基因172個，靶點基因信息見圖2。將172個靶點基因名稱導入Cytoscape-v3.2.1軟件，生成AS靶點蛋白質(zhì)相互作用關系PPI網(wǎng)絡，結果顯示與AS相關節(jié)點蛋白質(zhì)1851個，邊緣蛋白質(zhì)25 980個，AS的PPI網(wǎng)絡圖見圖3。

3.3 核心靶點信息

建立Hyp的PPI網(wǎng)絡和AS的PPI網(wǎng)絡的交集網(wǎng)絡后，可以得到93個節(jié)點蛋白質(zhì)和676個邊緣蛋白質(zhì)構成的交集網(wǎng)絡圖，交集網(wǎng)絡圖見圖4。對交集網(wǎng)絡圖的拓撲數(shù)據(jù)中Degree值進行排序，得到Degree最大值為57，計算所得Degree值中位數(shù)為13，將核心靶點篩選條件范圍設置為26～57，最終篩選結果得到10個核心靶點蛋白質(zhì)，具體核心靶點蛋白質(zhì)信息見圖5。

注：靶點；靶點相關節(jié)點蛋白質(zhì)。圖1 金絲桃苷PPI網(wǎng)絡圖

圖2 動脈粥樣硬化相關靶點信息

圖3 動脈粥樣硬化PPI網(wǎng)絡圖

注：表示Degree值由小到大。圖4 金絲桃苷PPI網(wǎng)絡和動脈粥樣硬化PPI網(wǎng)絡的交集網(wǎng)絡

圖5 核心靶點蛋白質(zhì)

3.4 核心靶點的GO注釋分析和KEGG通路分析結果可視化

通過DAVID數(shù)據(jù)庫分析，GO注釋分析結果顯示有9個基因有注釋數(shù)據(jù)，42個生物過程中有富集，設置篩選條件后，符合P<0.05的生物過程有29個，符合P<0.01的生物過程有12個，GO注釋分析信息見圖6。KEGG通路分析結果顯示有9個基因有注釋數(shù)據(jù)，17條通路有富集，設置篩選條件后，符合P<0.05的通路有7條，符合P<0.01的信號通路有4條，KEGG通路分析信息見圖7。在GO注釋分析和KEGG通路分析中都有富集的是磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路。

圖6 金絲桃苷治療動脈粥樣硬化的GO注釋分析

圖7 金絲桃苷治療動脈粥樣硬化的KEGG通路分析

4 討論

動脈粥樣硬化是導致冠心病的主要病理學基礎。早在18世紀中葉病理學家發(fā)現(xiàn)50%～70%的急性心肌梗死患者冠狀動脈固定狹窄<50%。1910年Osler認為，冠狀動脈粥樣硬化時，任何用力均可引起心肌缺血。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制一直是研究熱點，目前認為可能是多種發(fā)病機制共同作用的結果，涉及復雜和龐大的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡，包括血管損傷、炎癥、凋亡、細胞增殖和氧化應激等[8]。

我們前期實驗證明山楂總黃酮在降血脂和心肌缺血保護方面發(fā)揮重要的作用。金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷，是山楂中的主要化學成分之一，屬于黃酮醇類化合物，目前最突出的藥理活性是抗氧化應激、抗細胞凋亡、抗血栓和抗炎[9-10]。因此探索金絲桃苷對于動脈粥樣硬化的干預作用具有重要意義。

為了找到Hyp作用于AS的關鍵分子或調(diào)節(jié)結點，本文利用網(wǎng)絡藥理學的方法首先預測AS作用靶點蛋白質(zhì)172個和Hyp作用靶點蛋白質(zhì)8個，然后構建AS靶點蛋白質(zhì)相關的蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡和Hyp靶點蛋白質(zhì)相關的蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡，取兩個蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡的交集，得到交集節(jié)點蛋白質(zhì)93個，最后經(jīng)過篩選得到10個核心靶點蛋白質(zhì)，分別為EGFR、GRB2、NTRK1、HSP90AA1、HSP90AB1、FBO6、PSMA3、PTPN1、HUWE1和VCP。通過靶點蛋白進行GO注釋分析和KEGG通路分析，分析結果顯示PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路在GO注釋分析和KEGG通路中都有富集，因此，Hyp治療AS可能是通過PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路而發(fā)揮作用。

表皮生長因子受體(Human epidermal growth factor receptor，HER/erbB)家族是酪氨酸激酶受體(RTKs)，他們包括4種同源的跨膜蛋白：HER1(EGFR或erbB1)、HER2(neu或erbB2)、HER3(erbB3)和HER4(erbB4)[11]。表皮生長因子受體信號通路啟動首先是受體和配體形成二聚體，其中EGFR與HER2形成的異二聚體最常見，然后C-末端酪氨酸的磷酸化為具有SH2結構域或者PTB結構域的蛋白質(zhì)信號分子提供結合位點，這些信號分子包括：銜接蛋白(如GRB2)和激酶(如PI3K)，進行信號傳遞。啟動含有SH2結構域的信號轉(zhuǎn)導分子來激活MAPK級聯(lián)反應(含有銜接蛋白GRB2)和PI3K信號通路(含有激酶PI3K)[12]。因此，EGFR和GRB2兩個核心靶點蛋白質(zhì)可能在PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路中起到關鍵的作用。

PI3K屬于磷脂激酶家族，主要通過兩種方式激活：一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體(如EGFR)等或者銜接蛋白相互作用，引起聚二體構象改變而被激活；另一種是通過Ras和催化亞基直接結合導致PI3K活化，活化的PI3K進一步催化胞質(zhì)膜上PIP3的生成，PIP3與含有PH結構域的信號蛋白AKT結合而活化AKT[13-14]。PI3K/AKT信號通路在細胞增殖和凋亡方面發(fā)揮重要作用。

MAPK信號主要特點是具有MAPK級聯(lián)反應，MAPK至少有12種，分屬于ERK家族、p38家族和JNK家族，在不同的細胞中，MAPK通路成員組成及誘導的細胞應答有所不同。ERK在生長因子介導的細胞增殖過程中發(fā)揮重要作用。Ras屬于ERK家族，Ras/MAPK信號通路轉(zhuǎn)導表皮生長因子(EGF)信號，其基本過程是EGF與HER2形成異二聚體，激活受體的蛋白激酶活性，受體自身酪氨酸殘基磷酸化形成SH2結合位點，從而結合含有SH2結構域的接頭蛋白GRB2，進一步活化SOS分子，活化的SOS結合Ras蛋白，促進Ras釋放GDP、結合GTP，活化的Ras蛋白(Ras-GTP)可以激活MAPK級聯(lián)反應，通過磷酸化作用激活多種效應蛋白，從而發(fā)揮作用[15-16]。MAPK信號通路與細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡密切相關。

綜上所述，Hyp治療AS的機制可能是通過EGFR和GRB2兩個核心靶點蛋白質(zhì)調(diào)控PI3K/AKT和MAPK兩條信號通路，參與AS相關因子、蛋白和受體等重要調(diào)控分子的活化而影響AS的病理進程。

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