發(fā)酵蟲草菌粉多糖成分的理化性質及其對ConA抑制L-O2細胞增殖活性的影響

蔣洪亮，麻浩，何麗芳，趙修南，單俊杰*，王海南，3*

(1.貴州大學 藥學院，貴州 貴陽 550025；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 毒物藥物研究所，北京 100850；3.國家藥品監(jiān)督管理局，北京 100053)

發(fā)酵蟲草菌粉(Cs-4)是由我國科技人員從天然冬蟲夏草分離獲得Cs-4菌株，經(jīng)人工發(fā)酵培養(yǎng)制成。已有文獻報道將其用于肝病的治療，作為補益類藥物，推測多糖可能是其主要的藥效物質之一。為此，將發(fā)酵蟲草菌粉(Cs-4)粗多糖進行一系列分離純化，獲得均一成分CSMP-60-B-I，對其理化性質及其對ConA抑制人源肝細胞增殖活性的拮抗作用進行了初步研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UV-2000紫外分光光度計(上海龍尼柯儀器有限公司)；高效液相色譜儀(美國Waters公司Delta 600，2414示差檢測器)；分析天平(Ohaus公司)；LGJ-25 C冷凍干燥機(北京四環(huán)凍干機廠)；DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)；QL-861渦旋振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；MCO-15AC孵育箱(SANYO公司)；3001閃爍掃描酶標儀(Thermo公司)；BSZ-100型自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠)；Beckman P/ACETMMDQ Capillary Electrophoresis System(美國貝克曼庫爾特公司)。

1.2 材料

發(fā)酵蟲草菌粉(Cs-4，江西國藥有限責任公司，批號：Z10890021)。二乙胺基乙基纖維素(DEAE-Cellulose，上海恒信化學試劑有限公司)；Sephadex G-100(Pharmacia公司)；單糖、葡萄糖標準品(Sigma公司)；峰高分子量為6000、1.04×104、4.0×104、6.6×104和2.0×105Da的葡聚糖(Sigma公司)；三氟乙酸(TFA，99%，ACROS ORGANIC公司)；1-苯基-2-甲基-4-吡唑啉酮(PMP，99%，Aldrich公司)；人正常肝細胞株L-O2(軍事醫(yī)學科學院毒物藥物研究所李前教授惠贈)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；RPIM-1640液(Gibco公司)；胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)；胰蛋白酶(Amresco公司)；噻唑藍(MTT，Amresco公司)；刀豆蛋白A(Concanavalin，ConA，Sigma公司)；十二烷基硫酸鈉(SDS，Amresco公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 多糖CSMP-B-1的制備

稱取發(fā)酵蟲草菌粉1 kg，加15 L去離子水，置于60 ℃水浴中加熱提取4 h，然后多層紗布濾過，濾渣在相同條件下再重復提取1次。合并濾液，離心(3000 r·min-1，10 min)，上清液50～55 ℃減壓濃縮，濃縮液加入3倍體積95%乙醇水，靜置醇沉48 h。離心(3000 r·min-1，10 min)，分離沉淀，沉淀部分多次加入去離子水重復溶解多糖，離心(3000 r·min-1，20 min)得上清液，膜透析上清液72 h，以除去小分子雜質。將袋內(nèi)透析液離心，上清液減壓濃縮后，進行冷凍干燥，得到發(fā)酵蟲草菌粉粗多糖CSMP-60[1-3]。

稱取CSMP-60粗多糖1 g，加入20 mL水，置于60 ℃水浴中加熱溶解，離心，沉淀再重復操作1次。合并上清液上樣DEAE-纖維素色譜柱(6.0 cm×30 cm)，依次采用H2O、0.25 和0.5 mol·L-1NaHCO3洗脫，苯酚-硫酸法檢測含糖組分[6]，收集0.25 mol·L-1NaHCO3洗脫的含糖組分，水透析脫鹽、濃縮和冷凍干燥獲得多糖組分CSMP-60-B。CSMP-60-B再經(jīng)過Sephadex-G-100柱進一步分離和純化，最終獲得分子量均一多糖CSMP-60-B-1[4-6]。

2.2 CSMP-B-1的理化性質測定

2.2.1 純度鑒定和峰高分子量測定 用高效凝膠滲透色譜(HPGPC)方法，以TSK gel-G3000 PWXL(7.8 mm×300 mm)為色譜柱。流動相：0.1 mol·L-1Na2SO4溶液；進樣體積：20 μL；柱溫箱溫度：35 ℃；檢測器為2414示差檢測器和2998紫外檢測器。分別準確稱取5 mg峰高分子量為6000、1.04×104、4.0×104、6.6×104和2.7×105Da的葡聚糖標準品，分別加入500 μL 0.1 mol·L-1Na2SO4溶解，0.22 μm水系微孔濾膜過濾。濾液上樣。采用Waters Empower 2.0 GPC軟件處理實驗數(shù)據(jù)，以標準葡聚糖的保留時間(tR)為橫坐標，分子量的對數(shù)(lg Mp)為縱坐標，繪制多糖分子量的標準曲線。

準確稱取5 mg多糖CSMP-60-B-1，同樣加入500 μL 0.1 mol·L-1Na2SO4溶解、過濾和進樣。根據(jù)樣品峰形狀和保留時間，判斷多糖純度和計算其峰高分子量[7]。

2.2.2 單糖組成測定 CSMP-B-60-1完全酸水解：稱取5 mg CSMP-B-60-1，加入5 mL三氟乙酸(TFA)，密封后置于120 ℃烘箱中加熱2 h進行完全酸水解反應。水解液再多次加入甲醇，反復減壓蒸除殘留的三氟乙酸。待進行PMP衍生化。

單糖PMP衍生化[8-10]：準確稱取單糖標準品(氨基葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸)各10 mg，加5 mL超純水溶解，渦旋混勻。取40 μL標準單糖混合液于試管中，依次加入600 μL 0.3 mol·L-1氫氧化鈉和600 μL 0.5 mol·L-1PMP-甲醇溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配)。渦旋混勻，在70 ℃水浴中反應30 min，取出自然冷卻至室溫。緩慢加入600 μL 0.3 mol·L-1鹽酸，使溶液pH為7。加1 mL三氯甲烷萃取，向水相繼續(xù)加入1 mL三氯甲烷，重復萃取2次，合并水相，水相經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，進毛細管電泳分析。CSMP-B-60-1完全酸水解產(chǎn)物也按相同的PMP衍生方法，制備單糖衍生物，然后進行毛細管電泳分析。

毛細管電泳條件：緩沖鹽溶液為50 mmol·L-1硼砂溶液(pH=10.57)；毛細管柱為Φ50 μm×60 cm；分離電壓為15 kV；檢測波長為245 nm；進樣壓力為0.5 psi(1 psi=6.895 kPa)；進樣時間為10 s；柱溫為25 ℃。

2.3 細胞培養(yǎng)

細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)條件：從液氮冷凍保存的容器中取出L-O2細胞株，經(jīng)常規(guī)處理后接種入添加含10%FBS的DMEM液的玻璃瓶中，放于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的孵育箱靜置培養(yǎng)。3～4 d傳代1次，傳代時棄去培養(yǎng)上清液，用PBS淋洗1次，經(jīng)0.125%胰酶和0.01% EDTA-Na2的混合液消化后，以含10%FBS的DMEM液制成細胞懸液，按 1∶3傳代培養(yǎng)擴增，備用。

2.4 MTT法檢測細胞增殖活性

實驗設正常組、ConA模型組和多糖組，每組設平行6復孔。取對數(shù)生長期L-O2細胞，經(jīng)消化處理后，以10%FBS的DMEM液制成單細胞懸液，用Trypan blue液染色，WBC計數(shù)法計數(shù)活細胞總數(shù)，接種入96孔細胞培養(yǎng)板，密度為1×104/孔，培養(yǎng)箱孵育貼壁5 h。然后各多糖組分別加入用RPIM-1640液配制的使其終質量濃度為10、50、250 μg·mL-1的多糖(具有均一分子量)溶液。ConA模型組和多糖組再加入用RPIM-1640液配制的ConA溶液(500 μg·mL-1)。按常規(guī)靜置共孵育72 h。MTT顯色法檢測：向含有培養(yǎng)物的96孔板每孔加入0.5%MTT液20 μL，繼續(xù)于孵育箱培養(yǎng)4 h，去上清液，加入10%SDS液200 μL/孔，37 ℃溫箱過夜后在閃爍掃描酶標儀上570 nm波長檢測吸光度(A)值[11]。

2.5 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 多糖組分

粗多糖經(jīng)過DEAE-纖維素柱洗脫后，得3個洗脫峰，從左至右分別命名為CSMP-60-A(去離子水洗脫)，CSMP-60-B(0.25mol·L-1NaHCO3洗脫)，CSMP-60-C(0.5 mol·L-1NaHCO3洗脫)，結果見圖1。

圖1 CSMP-60在DEAE-纖維素柱洗脫曲線

CSMP-60-B進一步用Sephadex-G-100純化，用苯酚-硫酸法測定λ=490 nm的吸收峰，用λ=280 nm檢測非糖物質的吸收峰。最終CSMP-60-B組分經(jīng)過凝膠柱色譜分離得到單一峰，收集43管至63管，得到CSMP-60-B-I，結果見圖2。

圖2 CSMP-60-B在Sephadex G-100柱洗脫曲線

3.2 多糖純度及峰高分子量

運用高效凝膠滲透色譜法測得CSMP-60-B-I峰高分子量32 336 Da，而且峰型為單一對稱峰，結果見圖3。

圖3 CSMP-60-B-I的高效凝膠滲透色譜圖

3.3 單糖組成

運用毛細管電泳測得CSMP-60-B-I的單糖組成及比例為木糖-阿拉伯糖-葡萄糖-半乳糖-甘露糖(0.09∶0.20∶1.00∶3.70∶3.58)。標準單糖混合物和CSMP-60-B-1單糖混合物的CE圖譜分別見圖4和圖5。

3.4 CSMP-60-B-I對ConA抑制L-O2細胞增殖活性的影響

模型組ConA對L-O2細胞增殖活性具有明顯抑制作用，CSMP-60-B-I低、中、高劑量均對ConA抑制L-O2細胞增殖活性有拮抗作用，且呈現(xiàn)一定的量效關系，結果見表1。

注：1.氨基葡萄糖；2.木糖；3.阿拉伯糖；4.葡萄糖；5.鼠李糖；6.巖藻糖；7.半乳糖；8.甘露糖；9.葡萄糖醛酸；10.半乳糖醛酸。圖4 標準單糖PMP衍生物的CE圖譜

注：1.木糖；2.阿拉伯糖；3.葡萄糖；4.半乳糖；5.甘露糖。圖5 CSMP-60-B-I單糖衍生物的CE圖譜

表1 CSMP-60-B-I對ConA抑制L-O2細胞增殖活性的影響

注：與正常組比，***P<0.001；與模型組比，##P<0.01，###P<0.001。

4 討論

將發(fā)酵蟲草菌粉在60 ℃進行連續(xù)提取，制備粗多糖。利用DEAE-cellulose離子交換樹脂柱色譜和Sephadex-G-100 凝膠柱色譜對發(fā)酵蟲草菌粉粗多糖進行純化后得到白色粉末CSMP-60-B-I。

高效凝膠滲透色譜法具有操作簡單、快速、靈敏、重復性好和樣品量少等特點，成為目前測定多糖相對分子質量及其分布最理想的方法。應用高效凝膠滲透色譜法對CSMP-60-B-I進行純度鑒定，確定其為分子量均一的多糖，峰高分子質量為32 336。當然，通常所謂的多糖純品實質上是一定相對分子質量范圍的均一組分，它的純度只代表相似鏈長的平均配布。

多糖的單糖組成分析必須使用高效的分離技術，方可實現(xiàn)多糖組成單糖的有效分離。多糖單糖組成分析較常用的方法有薄層色譜法、氣相色譜法、HPLC、毛細管電泳法、離子色譜法等。毛細管電泳法具有樣品用量少、時間短、靈敏度高、分離效果明顯等優(yōu)點，采用毛細管電泳法對CSMP-60-B-I進行單糖組成分析，結果顯示CSMP-60-B-I的單糖主要為葡萄糖、半乳糖、甘露糖以及少量木糖和阿拉伯糖。關于CSMP-60-B-I的結構分析，將隨著實驗的深入另文報道。

已有研究顯示，高濃度ConA對肝細胞有損傷作用[12]，能抑制細胞增殖。而CSMP-60-B-I加入后，這種抑制作用大大減弱，在一定范圍內(nèi)，隨著劑量增加，甚至促進肝細胞的增殖。這一結果提示，CSMP-60-B-I可能對肝細胞有保護作用，其確切的保肝作用尚有待體內(nèi)實驗的進一步證實。

[1] 劉鵬，程顯好，劉亞麗，等.蟲草菌絲體多糖的提取方法[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33(3)：227-231.

[2] 劉華晶，許修宏，馬懷良，等.蛹蟲草菌絲體粗多糖提取方法初探[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報，2008，39(1)：58-61.

[3] 韓永萍，林強，何緒文.蟲草菌絲體多糖的提取研究[J].中國食用菌，2007，6(6)：53-55.

[4] 劉金花，李富奎，賈得儒，等.中國被毛孢發(fā)酵蟲草菌絲體多糖的提取、純化及其理化性質[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40(3)：222-226.

[5] 黃建忠，施巧琴，周曉蘭，等.粉被蟲草菌絲體多糖的分離純化及其性質[J].福建師范大學學報，1998，14(3)：82-85.

[6] 鄭必勝，唐芳勇，閆文娟，等.苯酚-硫酸法測定廣東蟲草菌絲體多糖含量的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊，2008(8)：18-22.

[7] 黃小方.板藍根多糖提取分離及其分子量測定的研究[D].揚州：揚州大學，2007.

[8] 張海英，凌建亞，呂鵬，等.毛細管區(qū)帶電泳定性分析蒙山九州蟲草菌絲體和發(fā)酵液多糖水解液組分[J].復旦學報(醫(yī)學版)，2007，34(3)：447-449.

[9] 文松.板藍根多糖佐劑理化性質及作用機理研究[D].貴陽：貴州大學，2015.

[10] 楊潔，姜廷福，王遠紅，等.高效毛細管電泳法測定海參多糖的單糖組成[J].中國海洋大學學報，2011，41(增刊)：344-348.

[11] 滕芳芳，胡曉斐，劉晨晨，等.LPS致肝細胞損傷模型的建立研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42(4)：1071-1073.

[12] 曹怡，劉波，徐彭，等.淫羊藿苷干預ConA 誘導體外BRL-3A 細胞損傷的機制[J].中藥藥理與臨床，2015，31(3)：21-24.