Bcl-2、Bad在大鼠癲癇持續狀態中的表達及rHuEpo干預的分子機制

于江華，史志勤，史諾菲，蘇旭東，周 毅，王 珊 賈麗景，趙 博，朱夢楚，馮曉紅，尹闊場，王維平

癲癇在任何年齡、地區和種族的人群中均有發病。癲癇發病有各種表現形式，但均可出現癲癇持續狀態(status epilepticus，SE)。而細胞凋亡是SE后神經元丟失的重要形式[1]。有些研究證實癲癇發作可以導致海馬神經元的損傷，同時這種損傷又成為反復癲癇發作時環路重建的重要因素之一[2]。PI3K/Akt(磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B)通路可能是癲癇發病的重要信號轉導通路，Bcl-2(B淋巴細胞瘤2)、Bad(Bcl-xl/Bcl-2相關死亡啟動因子)分別屬于抗凋亡、促凋亡蛋白，他們在線粒體凋亡途徑中起著重要作用。新近的研究發現促紅細胞生成素(EPO)的功能再也不是傳統認知上單純的造血因子，而是具有多種功效的重要因子。神經系統損傷的眾多動物模型的結果顯示，Epo可能通過抗細胞凋亡、促存活等各種機制不同程度地減輕腦損傷，改善神經系統功能[3～7]，但是Epo對癲癇持續狀態動物模型的抗凋亡作用機制尚不清楚。本研究利用戊四氮(Pentylenetetrazol，PTZ)誘導大鼠癲癇發作，建立癲癇持續狀態模型，觀察rHuEpo(recombinant human erythropoietin，rHuEpo)對戊四氮誘導的大鼠SE發作后神經元的凋亡以及對線粒體凋亡途徑相關調控因子Bcl-2、Bad表達的影響，同時觀察是否PI3K/Akt途徑是Epo發揮抗凋亡、促存活作用的重要通路。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 成年健康雄性SD大鼠(由河北省實驗動物中心提供)。起始體重范圍要求：(220±20)g，分籠喂養。

1.2 主要實驗試劑及器材 選用美國Sigma公司生產的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、LY294002以及PTZ；華藥生產的重組人促紅細胞生成素(Recombinant human Epo，rHuEpo)；美國santacruz公司生產的兔抗p- Akt (Thr-308)多克隆抗體、兔抗Bcl-2、Bad多克隆抗體；美國Promega公司生產的RT-PCR反轉錄及擴增試劑；生工生物工程(上海)股份有限公司制造的引物；德國Eppendorf公司生產的PCR儀；英國Syngene公司生產的凝膠掃描分析系統。

1.3 方法

1.3.1 SE模型制備及實驗分組 用197只大鼠依據公認的給藥途徑和劑量制備模型：開始時用腹腔注射方式給予PTZ20 mg/kg，之后每次注射10 mg/kg，每次間隔時間10 min，出現全身性驚厥大發作和/或發生SE時停止給藥，并對大鼠給藥后的表現進行評價。出現Racine六級評價標準中規定的Ⅳ、Ⅴ級表現時，歸為全身性驚厥大發作，發作時間達到或者超過30 min視為癲癇持續狀態。為保證實驗規模，去除中途死亡和未成功造模的大鼠并隨機補充。最終成功造模125只，隨機分為5組：正常對照組(NS)、模型組(PTZ+NS)、rHuEpo干預組(PTZ+rHuEpo)、LY294002干預組(PTZ+rHuEpo+LY294002)、LY294002對照組(PTZ+rHuEpo+DMSO)，各組隨機平均分配25只大鼠。

1.3.2 給藥 模型組：首先以PTZ引發SE，持續30 min后予以0.9%氯化鈉溶液2 ml腹腔注射；rHuEpo干預組：首先以PTZ引發SE，持續30 min后予以rHuEpo 5000 U/kg腹腔注射；LY294002干預組：(以DMSO為溶媒，調整LY294002濃度為10 μg/5 μl)，首先以PTZ引發SE，持續10 min后以5 μl LY294002行腦室注射，SE持續30 min后以rHuEpo 5000 U/kg行腹腔注射；LY294002對照組：首先以PTZ引發SE，持續10 min后以5 μl DMSO行腦室注射，SE持續30 min后以rHuEpo 5000 U/kg行腹腔注射；正常對照組：以同等體積的0.9%氯化鈉溶液行腹腔注射。

1.3.3 大鼠側腦室立體定位及注射給藥 以《The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates》內數據為標準，對注射部位予以定位(前囟后移0.8 mm，矢狀縫側移1.5 mm，硬腦膜下3.8 mm)。首先以PTZ引發SE，持續10 min后，LY294002干預組注射5 μl LY294002，LY294002對照組注射5 μl DMSO，注射后不拔針，5 min后再緩慢拔針，同時觀察大鼠行為學狀態。

1.3.4 大鼠行為學觀察及腦電圖(electroencephalogram，EEG)描記 實驗大鼠行為學觀察：給藥后不間斷觀察2 h，對其有無癲癇發作、癲癇發作的表現形式、持續時間等做詳細記錄。腦電圖描記：各組隨機抽選5只予以EEG記錄。麻醉后固定在定位儀上，充分暴露顱骨。左右兩側皮質及海馬區域共用4個電極連接8個導聯，大鼠清醒后開始記錄。

1.3.5 海馬組織學觀察 SE發作24 h后對其實施過量麻醉、插管、灌注、開顱取腦，垂直橫斷，進行浸泡、脫水、包埋、切片等一系列的工作，做免疫組化染色與TUNEL染色。

1.3.5.1 TUNEL染色 選取TUNEL試劑盒，脫蠟、水化、孵育、顯色、復染等步驟至封片。各份標本均依上述方法處理3張切片，在海馬區任意取10個彼此沒有重疊的視野，計算其中有染色且可見細胞核的細胞數目，每份標本的30個計數結果取平均值作為該標本最終結果，組內各樣本再取平均值取得本組結果。

1.3.5.2 免疫組織化學染色 應用Streptavidin-Perosidase(SP)法。進行脫蠟、水化、洗滌、阻斷等步驟，添加1∶200的兔抗P-Thr308-Akt多克隆抗體，1∶200的兔抗Bcl-2多克隆抗體和1∶150的兔抗Bad多克隆抗體，加入二抗。以PBS取代抗體構成對照組，觀察目標為海馬組織中Bcl-2和Bad的陽性細胞的數目。對標本的記取和計算方法與TUNEL染色相同。

1.3.6 RT-PCR檢測 隨機選取每組中的10只實驗大鼠，迅速取出海馬組織，抽提海馬組織總的RNA，測定其濃度大小和純度水平。每份樣品取2 μg反轉錄其互補DNA，以互補DNA中1μg作為PCR底物進行擴增。用5μl逆轉錄PCR的產物做瓊脂糖凝膠電泳，定量其條帶灰度并分析取得半定量結果，重復5次計算平均值后進行統計學分析。產物的相對含量用Bad/β-actin和Bcl-2/β-actin表示。

1.3.7 Western blot檢測 隨機選擇每組中的10只實驗大鼠，迅速取出海馬組織，對總蛋白進行濃度測定(BCA法)。添加1∶300的多克隆兔抗Akt、p-Akt抗體、1∶200的兔抗Bcl-2多克隆抗體和1∶150的兔抗Bad多克隆抗體，TPBS漂洗后加入1∶3000的羊抗兔IgG熒光抗體，孵育、漂洗，對目標條帶與β-actin條帶進行掃描并測定其單位密度，計算二者比值進行統計學處理。重復5次計算平均值，進行最終統計學分析。

2 結 果

2.1 大鼠行為學改變 實驗中接受PTZ注射的共有197只大鼠，引發出現驚厥的最低劑量和數量分別為：30 mg/kg(75只)、40 mg/kg(77只)、50 mg/kg(45只)。PTZ注射劑量隨著時間梯度遞增，驚厥的主要體現形式分別為節律性縮頭、肌陣攣、逐漸出現的四肢抽搐、口唇周圍發紫，繼而出現全身性強直-陣攣驚厥，SE持續時間>30 min。制模過程中約為35%大鼠死亡，另有3只未能成功建模，均予以剔除并隨機補充。對照組未出現行為學改變。

2.2 腦電圖變化 模型組腦電圖可見大量高波幅的尖波、棘波、尖慢/棘慢復合波等癇樣放電，呈現陣發性放電特點；對rHuEpo干預組、LY294002干預組和LY294002對照組的腦電圖進行觀察發現大鼠癇性放電受到顯著抑制；與LY294002干預組相比，rHuEpo干預組、LY294002對照組的癲癇樣放電明顯減少。

2.3 TUNEL染色結果 見表1。細胞核棕黃色著色者為TUNEL陽性細胞。具體表現為：在正常對照組中散在出現少許凋亡細胞，在其余各組中凋亡細胞均有所增加且程度不同。正常對照組凋亡細胞數目顯著少于其他4組(P<0.05)；模型組凋亡細胞數目有顯著的提高，rHuEpo干預組、LY294002干預組和LY294002對照組凋亡細胞數目顯著少于模型組 (P<0.05)；rHuEpo干預組、LY294002對照組凋亡細胞數目與LY294002干預組相比也明顯減低 (P<0.05)，LY294002對照組凋亡細胞數目雖多于rHuEpo干預組，但未表現出統計學差異(P>0.05)。

2.4 免疫組化染色結果 海馬區p-Akt、Bcl-2、Bad蛋白的表達見表1～表3、圖1、圖2。神經元胞漿呈棕黃色著色視為染色陽性。正常對照組胞漿偶有棕黃色散在顆粒分布其中；相較于正常對照組，p-Akt、Bcl-2、Bad陽性細胞分布在其余4組均表現為顯著增加的特點，具有統計學差異(P<0.05)；LY294002干預組、LY294002對照組、rHuEpo干預組p-Akt、Bcl-2的陽性細胞數目明顯多于模型組，而Bad的陽性細胞數目顯著少于模型組，具有統計學差異(P<0.05)；與LY294002干預組相比，rHuEpo干預組、LY294002對照組p-Akt、Bcl-2的陽性細胞數更多，Bad的陽性細胞數更少，體現出統計學差異(P<0.05)；與LY294002對照組相比，rHuEpo干預組p-Akt、Bcl-2的陽性細胞數更多，Bad的陽性細胞數更少，但未體現出統計學差異(P>0.05)。

2.5 RT-PCR測定Bcl-2 mRNA、Bad mRNA的表達 見表2、表3、圖3、圖4。對照組Bcl-2 mRNA、Bad mRNA均有微弱表達；與正常對照組相比，模型組、rHuEpo干預組、LY294002對照組、LY294002干預組Bcl-2 mRNA、Bad mRNA的表達均有顯著升高(P<0.05)；模型組Bad mRNA的表達水平與rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較明顯升高，Bcl-2 mRNA的表達水平則明顯降低(P<0.05)；與LY294002干預組相比，rHuEpo干預組、LY294002對照組Bad mRNA的表達明顯減少，Bcl-2 mRNA的表達水平明顯升高(P<0.05)；與LY294002對照組相比，rHuEpo干預組Bad mRNA的表達有所減少，Bcl-2 mRNA的表達水平有所升高，但未體現出統計學差異(P>0.05)。

2.6 Western blot測定Akt、p-Akt、Bcl-2和Bad蛋白的表達 見表1～表3、圖5、圖6。大鼠海馬組織Akt及p-Akt、Bcl-2、Bad蛋白表達顯示：與模型組、rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較，對照組p-Akt、Bcl-2、Bad蛋白的表達明顯減少(P<0.05)；與rHuEpo干預組、 LY294002干預組、 LY294002對照組相比，PTZ組p-Akt、Bcl-2蛋白的表達出現明顯下調的特征，Bad蛋白的表達出現明顯上調的特征(P<0.05)；與LY294002干預組比較，rHuEpo干預組、LY294002對照組p-Akt、Bcl-2蛋白的表達水平明顯升高，Bad蛋白的表達水平明顯降低，體現出統計學差異(P<0.05)；雖然LY294002對照組與rHuEpo干預組相比，p-Akt、Bcl-2蛋白的表達減少，Bad蛋白的表達增多，但未體現出統計學差異(P>0.05)。rHuEpo、LY294002、DMSO的干預對Akt的表達水平未產生明顯影響，其表達水平在各組間未體現出統計學差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠海馬區凋亡細胞、p-Akt陽性細胞計數、p-Akt蛋白表達

對照組與模型組、rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較*P<0.05；模型組與rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較ΔP<0.05；LY294002干預組與rHuEpo干預組、LY294002對照組比較▲P<0.05；rHuEpo干預組與LY294002對照組比較沒有顯著差異

表2 各組大鼠海馬區Bcl-2陽性細胞、Bcl-2 mRNA、Bcl-2蛋白表達計數

對照組與模型組、rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較*P<0.05；模型組與rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較ΔP<0.05；LY294002干預組與rHuEpo干預組、LY294002對照組比較▲P<0.05；rHuEpo干預組與LY294002對照組比較沒有顯著差異

表3 各組大鼠海馬區Bad 陽性細胞、Bad mRNA、Bad蛋白表達計數

對照組與模型組、rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較*P<0.05；模型組與rHuEpo干預組、LY294002干預組、LY294002對照組比較ΔP<0.05；LY294002干預組與rHuEpo干預組、LY294002對照組比較▲P<0.05；rHuEpo干預組與LY294002對照組比較沒有顯著差異

A：對照組；B：模型組；C：rHuEpo干預組；D：LY294002干預組；E：LY294002對照組圖1 各組大鼠海馬區BCL-2陽性細胞表達情況(SP×400)

A：對照組；B：模型組；C：rHuEpo干預組；D：LY294002干預組；E：LY294002對照組圖2 各組大鼠海馬區Bad陽性細胞表達情況(sp×400)

control：對照組；PTZ：模型組；rHuEpo：rHuEpo干預組；LY294002：LY294002干預組；DMSO：LY294002對照組
圖3 每組大鼠Bcl-2 mRNA的表達情況

control：對照組；PTZ：模型組；rHuEpo：rHuEpo干預組；LY294002：LY294002干預組；DMSO：LY294002對照組
圖4 每組大鼠Bad mRNA的表達情況

control：對照組；PTZ：模型組；rHuEpo：rHuEpo干預組；LY294002：LY294002干預組；DMSO：LY294002對照組
圖5 每組大鼠Bcl-2蛋白的表達情況

control：對照組；PTZ：模型組；rHuEpo：rHuEpo干預組；LY294002：LY294002干預組；DMSO：LY294002對照組
圖6 每組大鼠Bad蛋白的表達情況

3 討 論

癲癇持續狀態是神經科的急癥，死亡率約為10%～12%[8]。PTZ本身并無其他的神經毒性作用，所以PTZ作為致癇劑是一種較為科學的選擇。本實驗應用腦電圖和Racine分級依據來做為檢測造模是否成功的標準。已有研究顯示SE發作后凋亡是非常重要的損傷形式[9]，但其發生機制還不清楚。本研究在應用PTZ作為致癇劑的SE模型中采用TUNEL染色的辦法來觀察凋亡細胞的變化情況，結果顯示：模型組海馬區域的神經元出現壞死和凋亡的特征，凋亡細胞數量較正常對照組增多。線粒體依賴途徑在凋亡中有著舉足輕重的作用。Bcl-2家族蛋白的主要位點和作用位點均在線粒體膜上，Bcl-2家族被稱為“凋亡的看門人”，是決定細胞命運走向的關鍵，Bcl-2、Bad都是Bcl-2家族中非常重要的關鍵因子。本實驗采用免疫組織化學、逆轉錄-PCR、Westernblot等實驗方法觀察Bcl-2、Bad的變化情況，實驗結果顯示：模型組與正常對照組比較，Bcl-2和Bad免疫陽性細胞、Bcl-2 mRNA、Bad mRNA及Bcl-2、Bad蛋白表達均顯著上調，表明PTZ激活了Bad、Bcl-2在海馬神經元中的表達且表達水平明顯增高。Henshall[10]和Meller[11]的實驗研究也發現，神經元凋亡時Bcl-2、Bad蛋白可能被激活并參與其中，與我們的實驗結果較為一致。腦組織中許多類型的細胞都含有Epo受體并且也可以產生內源性Epo[12]。本實驗將rHuEpo作為神經保護劑在SE后30 mim行腹腔注射，實驗結果顯示rHuEpo的干預可明顯減少癲癇樣放電的發生，上調海馬神經元內Bcl-2蛋白及mRNA的表達，下調促凋亡蛋白Bad及mRNA表達，提示rHuEpo可以調控這些線粒體凋亡途徑相關因子的表達水平，減少海馬神經元的壞死、凋亡，發揮神經保護作用。基于以上研究，進一步了解rHuEpo是如何對Bcl-2和Bad進行調控發揮抗凋亡作用的機制，成為了我們新的研究靶點。

PI3K/Akt信號傳導通路是一條經典的調節細胞的生長、增殖、分化、生存的信號轉導通路。Li[13]，Uzum等[14]研究發現PI3K / Akt信號通路參與了改善記憶、抗癲癇的神經保護作用。Epo引起Akt的活化是其發揮抗細胞凋亡作用的關鍵。Akt是PI3K的直接下游底物，可以通過對p-Akt表達的觀察，間接了解PI3K/Akt通路的激活狀況。在我們的研究中通過免疫組化及Western blot等實驗方法對SE大鼠p-Akt的表達進行觀察，進而了解到PI3K/Akt通路的激活狀況。本研究發現rHuEpo的干預可以使海馬神經元內p-Akt的水平顯著提高，顯示 rHuEpo所發揮的神經保護作用與激活PI3K/Akt通路密切相關。PI3K/Akt通路實現其促進細胞存活的作用也是通過對其下游的凋亡相關蛋白進行調節并借以發揮一系列重要的生物學效應。有研究發現PI3K/Akt/Bad、PI3K/Akt / Bcl-2信號傳導通路在細胞凋亡中發揮一定的保護作用[15～17]，應用PI3K 抑制劑LY294002可以阻止由于增加磷酸化Akt水平而發揮的保護作用[18，19]。在本次實驗中我們也進行了更加深入的研究，從反證的角度進一步觀察在PTZ致癇SE大鼠模型中rHuEpo是否經PI3K/Akt通路，對線粒體凋亡途徑相關調控因子Bcl-2和Bad實施調控，進而發揮神經保護作用。我們應用PI3K抑制劑LY294002進行阻斷，本實驗結果提示給予LY294002實施阻斷，rHuEpo的保護作用被明顯減弱，LY294002干預組與rHuEpo組相比較，癇樣放電頻率、海馬神經元凋亡細胞數目都有明顯增加，在免疫組織化學和Western blot的試驗結果中顯示p-Akt和Bcl-2陽性細胞的數量以及Bcl-2 mRNA和蛋白的表達也明顯降低，同時Bad陽性細胞的數量以及Bad mRNA和蛋白的表達上調，更有力的證實了rHuEpo可以提高Akt的活性，激活PI3K/Akt信號傳導途徑，進而對線粒體凋亡途徑中的Bcl-2和Bad進行調節，借以發揮抗凋亡的神經保護作用。

本研究仍存在一定的局限之處：未進行多時間點的大樣本量的觀察，信號通路之間交叉串聯，錯綜復雜，PI3K/Akt通路并不是Epo的唯一信號通路，它與其他通路之間是如何進行“cross talk”，實現神經保護作用的問題，我們正在進行著更為深入的研究。綜上所述，Epo發揮促神經元存活的作用機制是通過PI3K/Akt通路對線粒體凋亡途徑的相關因子Bcl-2和Bad進行調控，來實現抗凋亡的重要作用。Epo及氨甲酰化Epo的研究也正在進行，以盼為尋找有效可行的治療癲癇的神經保護劑提供重要的實驗室依據。

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