四環素基因表達系統的研究進展

尚冰清

（徐州醫科大學臨床醫學系院 江蘇 徐州 221006）

基因的表達調控，涉及到多個因素的互相作用，是一個較為復雜的過程。在基因治療中，如果對目的基因的表達時間和表達水平能進行精準調控，就能夠有效的降低其副作用的發生率，提高治療效果，為基因治療提供重要的理論基礎。一般來說，一個理想的可誘導表達系統具有以下特點：特異性、非干擾性、可誘導性、可逆性、劑量依賴性。目前，較為成熟的誘導表達系統有四環素誘導系統，蛻皮激素誘導表達系統，RU486誘導系統。其中四環素誘導調控系統應用最為廣泛，本文簡要回顧了其發展過程和應用研究。

1.四環素調控的基因表達系統的分子學機制

1.1 Tet調控系統

1992年，Gossen等最早建立了Tet-off基因調控系統，該系統是在大腸桿菌轉座子Tn10中，以Tet阻遏因子(TetR)負性調控四環素操縱子為基礎而建立的。含有調節質粒和反應質粒兩部分(如圖1.A)。調節質粒是一個四環素調控的轉錄因子(tTA)，由單純皰疹病毒(HSV)VP16蛋白中含有127個氨基酸的轉錄激活結構域(activation domain，AD)與含有207個氨基酸的四環素阻遏蛋白(TetR)融合而成。反應質粒包含目的基因和四環素反應元件(Ptet)。Ptet包含7個正向排列的Tet0 序列，含有TATA盒的多克隆位點在其下游，是巨細胞病毒的最小啟動子(minimal CMV promoter，PminCMV)。因為該啟動子缺乏增加子，無四環素(Tc)或者強力霉素(dox)不存在的情況下，tTA與Ptet特異性結合，目的基因得以表達。而Tc或dox可特異性結合tTA，分離tTA與Ptet，阻止下游轉錄。

圖1.四環素調控系統

在1995年，Gossen等在tTA的結構基礎上發現了它的反向突變體rtTA，建立了Tet-on調控系統(如圖1.B)。rtTA與tTA有4個氨基酸發生了突變，與當有Tc存在時，rtTA才能與Ptet特異性結合，啟動下游基因的表達。由于活體組織攝取Tc要比清楚快的多，因此在基因轉錄方面，Tet-on調控系統要比Tetoff調控系統迅速的多。

1.2 Tet調控系統的優點

Tet調控系統特異性強，且具有較高的誘導效率。特異性的原因尚不明確，猜測是由于四環素反應元件來自原核生物，而原核調節蛋白的DNA靶序在真核細胞中是不存在，故其靶序作用很特異。且不影響真核基因組表達。Tet系統在無誘導時，目的基因表達量低甚至無表達，四環素調控系統具有低背景表達和高水平誘導兩大特點。此外，相比較于其他系統的誘導因子如激素、熱休克，四環素作為抗生素，對細胞的毒害性較小。

Tet-off/Tet-on系統能夠有效的控制目的基因表達，尤其是Tet-on系統。但該系統仍不夠完善:rtTA的穩定性不能令人滿意，在一些細胞內容易降解；更為重要的是基因泄露問題:在非誘導情況下，rtTA與tetO仍具有一定的結合率，誘導基因表達，致使目的基因的基礎表達水平較高。

2.Tet調控系統的應用

隨著不斷研究和改進，四環素誘導表達調控系統可廣泛應用于細胞的體外培養、轉基因小鼠以及其他動物的誘導性基因表達研究中。誘導性基因表達系統可以在時間上調控基因的表達，作為基因功能研究重要工具之一。其中的四環素誘導的基因表達系統，是應用最廣泛的一種。在此基礎上相繼建立了雙向啟動子調控的轉基因表達系統、與四環素控制的轉錄沉默系統（tTS）以及Cre/loxP系統結合的誘導性條件性基因敲除系統，它們在研究哺乳動物基因的功能及表達調控方面發揮了重要作用[1-2]。

其中，它在基因治療方面的研究得到了廣泛的關注。

通過tet調控系統來調節GDNF表達來治療帕金森氏病，該系統將會適時決定關閉基因表達或調控基因表達來阻止由于細胞異常增殖帶來的不良副作用，如細胞連接錯誤，或釋放出的異常神經遞質。2009年，Manfredsson等成功驗證了rAAV-TetOff載體在大鼠腦中的有效調控。相對于病毒載體來說，tet調控系統僅需較小的誘導劑量，當dox濃度為0.3μg/ml時，GDNF的表達完全消失[3]。然而有研究[4]表明，由于血腦屏障的存在，需要維持較高的血漿 dox濃度而相對較低腦脊液（CSF）來誘導大腦中rtTA2S-M2驅動的轉基因表達。應該避免長期高劑量的dox的毒副作用，因此，在較低dox水平下更活躍的新rtTA變體是可取的。

有研究[5]表明，通過構建的以DNA載體介導的能夠高效調控siRNA沉默基因效應的Tet-On基因表達系統，能夠促進其在更多模型系統中進行基因功能研究的應用。通過構建DNA載體介導的小干擾RNA(siRNA)Tet-on表達載體，pDIRS4.1 siRNA。隨著Dox濃度升高，pDIRS4.1 siRNA載體在人成骨肉瘤細胞中對目的基因的沉默作用有較好的調控性，且目的基因的表達與Dox具有嚴格的劑量依賴關系，高濃度Dox時，IL-6表達水平降低約12倍。

此外，有研究[6]表明，通過構建攜帶四環素真核誘導表達系統(Tet-on)調控的人骨形態發生蛋白2(hBMP-2)慢病毒載體轉染大鼠骨髓間充質干細胞(BMSCs)，可為骨缺損修復提供可控的成骨活性細胞。構建攜帶可調控系統的感染293T細胞后獲得hBMP-2-GV347慢病毒濃縮液，在DOX誘導下轉染后的BMSC細胞增殖能力較普通BMSC強，并在DOX濃度為10μg/ml誘導下穩定表達BMP-2蛋白和RNA。

Tet生物功能和催化機制的研究將有助于深入了解與DNA去甲基化途徑相關腫瘤的發生和發展機制，同時也為研發全新的抗腫瘤靶向藥物提供參考。

基因治療的目的：是為當前尚無完善的治療方案的疾病提供更為合適的治療方法。目前，國際上已在臨床上試行的基因治療超過300例，包括惡性腫瘤、神經性疾病、心血管疾病、感染性疾病和眼病等。迄今為止，已經利用腺病毒載體或者逆轉錄病毒載體在I、Ⅱ和Ⅲ期臨床實驗中來治療惡性膠質瘤。

四環素基因調控系統是目前應用最廣的調控系統，已被用于多種載體中，已經被編碼在慢病毒屬、腺病毒屬、腺相關病毒屬和逆轉錄病毒屬，而且可以有效地對基因進行調控，這增加了Tet系統在不同器官中應用的可能性。為增強其安全性，還需繼續對調控的嚴密性和特異性進行進一步的改進和發展。

[1]Shetty D K．Shetty R，Inamdar M S.Generation of OCIADl inducible overexpression human embryonic stemcellline:BJN-hem20-OCIADl-Tet-On[J].Stem Cell Res，2016，16(2)：246-248．

[2]Yao M，Lu X，Lei Y，et a1．Conditional inducible tripletrans-genic mouse model for rapid real-time detection of HCV NS3/4A protease activity[J]．PLoS One，2016，11(3)：e0150894．

[3]Manfredsson FP, Burger C, Rising AC, et al.Tight Longterm dynamic doxycycline responsive nigrostriatal GDNF using a single rAAV vector[J].MolTher 2009;17(11):1857-67.

[4]Centlivre M, Zhou X, Pouw SM, et al.Autoregulatory lentiviral vectors allow multiple cycles of doxycyclineinducible gene expression in human hematopoietic cells in vivo [J].Gene Ther 2010; 17(1): 14-25.

[5]李朵璐，周玉冰，韓超，et al.DNA載體介導的小干擾RNA Teton基因表達系統的調控效應檢測[J].中國現代醫學雜志，2017，7;30-35.

[6]白波黃弘軒黃芳立，et al.人骨形態蛋白-2可調控系統在大鼠骨髓間充質干細胞的表達[J].中華關節外科雜志（電子版），2017，6; 622-628.