紡錘體檢查點功能復(fù)合物基因MAD1L1遺傳變異與潮汕地區(qū)女性乳腺癌易感性研究

楊少宜，張慶英，*，吳俊東，林秋強，王銳鋒，鄭慶元，蔡奮

（1．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，廣東汕頭515041；2．汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院，廣東汕頭515041；3．汕頭市澄海區(qū)人民醫(yī)院，廣東汕頭515899；4．汕頭市金平區(qū)婦幼保健院，廣東汕頭515041）

乳腺癌是嚴(yán)重威脅世界女性健康的常見惡性腫瘤，全球范圍內(nèi)，每年有超過100萬人被確診患乳腺癌，至少40萬人死于該疾病，占全部腫瘤死因的14%，位居女性死因榜首[1]。近30年來中國乳腺癌的發(fā)病率增長了20%~30%，并以每年3%~5%的速度增長且呈現(xiàn)出年輕化的趨勢[2-3]，已成為突出的公共衛(wèi)生問題。因此，探究與乳腺癌發(fā)病相關(guān)的環(huán)境及遺傳因素及其作用機制對于乳腺癌的防治有著重要意義。

染色體非整倍性是人類實體腫瘤最為普遍的特征，被證實與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-5]。有絲分裂阻滯缺陷1類似物1(mitotic arrest deficient1-like1，MAD1L1)作為紡錘體組裝檢驗點(the spindle-assembly checkpoint，SAC)的重要組成成員，在細(xì)胞周期調(diào)控中通過與有絲分裂阻滯缺陷2類似物1(MAD2L1)結(jié)合形成四聚體復(fù)合物共同在啟動檢驗點信號中發(fā)揮作用，MAD1L1結(jié)構(gòu)上的異常均可能導(dǎo)致SAC功能失活，進而導(dǎo)致染色體非整倍性或癌變[6-9]。在前期的研究中，研究者發(fā)現(xiàn)定位于染色體7p22.3區(qū)域內(nèi)存在著一個MAD1L1基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點，即rs1801368，該位點上堿基的突變會導(dǎo)致所編碼的氨基酸由精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻M氨酸，進而削弱其在執(zhí)行有絲分裂阻滯功能上的作用，可能導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定的發(fā)生[8-9]。相關(guān)研究報道亦證實該位點的突變與肺癌及結(jié)直腸癌患病風(fēng)險相關(guān)[6，10]，但目前關(guān)于該位點的變異與乳腺癌的關(guān)系尚未見報道。據(jù)此，本研究通過分析潮汕地區(qū)女性乳腺癌患者及對照人群中的M AD1L1rs1801368位點的基因變異情況，結(jié)合生理指標(biāo)、臨床指標(biāo)、疾病史、生活方式等指標(biāo)，揭示環(huán)境與M AD1L1rs1801368遺傳變異與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

采用病例-對照研究，入選2015年12月—2017年12月就診于汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院初診為乳腺癌、未經(jīng)化療和放療的住院患者作為病例，選取同期居住在潮汕地區(qū)的健康居民作為對照。所有患者的確診均以組織病理學(xué)檢查結(jié)果為依據(jù)，同時排除患兩種或兩種以上惡性腫瘤、既往有腫瘤史及乳腺癌非原發(fā)腫瘤患者。健康對照的納入標(biāo)準(zhǔn)為：與乳腺癌患者無親緣關(guān)系；無腫瘤史或乳腺疾病史；經(jīng)乳腺彩超、乳腺X線檢查無任何患乳腺癌或可疑乳腺癌前損傷或患其他腫瘤跡象。本研究共納入病例191例，健康對照225例，經(jīng)研究對象知情同意，并獲得汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理委員會通過。

1.2 調(diào)查方法

乳腺癌病例的調(diào)查采用病歷回顧的方式獲得人口統(tǒng)計學(xué)特征信息(包括年齡、住址、職業(yè)、民族、受教育程度、醫(yī)保類型)，女性生理生育指標(biāo)(初潮年齡、絕經(jīng)與否、絕經(jīng)年齡、月經(jīng)周期、生育狀況、哺乳情況等)，生活方式(吸煙、飲酒狀況)，人體測量指標(biāo)(身高、體質(zhì)量、血壓、心率、心電圖)，生化指標(biāo)(總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖)，臨床病理 指 標(biāo)[腫瘤病理類型、腫瘤體積、臨床TNM分期、雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕酮受體(progesteronereceptor，PR)、人表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2)、細(xì)胞增殖核抗原Ki-67(nuclcar-associated antigen Ki-67，Ki-67)狀態(tài)、分子分型和組織學(xué)分級]及疾病史(糖尿病史、高血壓病史、血脂代謝紊亂病史、乳腺癌家族史、癌癥家族史、良性乳腺疾病史)。

健康對照的調(diào)查采用現(xiàn)場問卷調(diào)查、體格檢查、生化檢查的方式，對自愿接受調(diào)查者簽署知情同意書，強調(diào)隱私保護。調(diào)查問卷的內(nèi)容涵蓋上述人口統(tǒng)計學(xué)特征、女性生理生育指標(biāo)、疾病史。現(xiàn)場獲得人體測量參數(shù)并采集非抗凝血樣2 m L，其中1 m L通過生化檢測儀獲得對照生化指標(biāo)，另1 m L用于后續(xù)基因分型。

1.3 DNA提取

采用DNA提取試劑盒提取病例及對照樣本全基因組 DNA (QIAamp DNA BloodMini Kit， 貨 號 51106)，DNA的濃度、純度經(jīng)NanoDrop2000微量紫外分光光度計測定。提得的DNA樣本置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因分型

將DNA樣本統(tǒng)一配制為40ng/μL的濃度，通過鼓風(fēng)干燥箱對樣本進行烤干。采用國際主流SNP分型TaqMan熒光雙標(biāo)記探針法對入選位點進行基因分型，實驗中所需PCR引物和TaqMan探針由ABI公司設(shè)計合成。PCR反應(yīng)體系為(總體積5μL)：TaqManTMUniversalMasterMix2.5μL，40×探針0.125μL，超純水2.375 μL。應(yīng)用ABI QS12K高通量熒光定量PCR系統(tǒng)對樣本進行基因分型，擴增條件如下：50℃預(yù)變性2min→95 ℃變性15s→60 ℃ 退火1min→60℃延伸90s，50個循環(huán)。通過隨機抽取5%的樣本進行二次分型，以對分型結(jié)果進行重復(fù)性檢驗，兩次結(jié)果一致率控制在95%以上。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS21.0進行統(tǒng)計分析。計量資料以-x±s表示，計數(shù)資料以例數(shù)及百分比表示。對于服從方差齊性、正態(tài)性的計量資料采用t檢驗，不服從正態(tài)性的計量資料或等級資料采用Mann-Whitney U檢驗或Kruskal-Wallis H檢驗。率或構(gòu)成比的比較采用 χ2檢驗，病例與對照的基因型頻率分布比較采用 χ2檢驗或精確檢驗法進行統(tǒng)計分析，運用二分類非條件Logistic回歸分析不同基因型與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 病例組與對照組的一般特征比較

病例組與對照組在年齡、身高、體質(zhì)量上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但在職業(yè)與受教育程度上的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。生化指標(biāo)方面，病例組的平均心率、收縮壓、舒張壓、空腹血糖值均高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；病例組的總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白均值均低于對照組，兩組在高密度脂蛋白指標(biāo)上差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 乳腺癌患者與健康對照一般特征比較(-)x±s

2.2 病例組與對照組女性相關(guān)危險因素比較

乳腺癌患者與健康對照在初次生育年齡、哺乳方式、絕經(jīng)狀態(tài)上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，兩組在初潮年齡、孕數(shù)、生育胎數(shù)、最長哺乳時間及流產(chǎn)胎數(shù)方面差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。相關(guān)疾病史方面，病例組中14例有乳腺癌家族史(7.4%)，35例有癌癥家族史(18.4%)；對照組中均無乳腺癌家族史，3例有癌癥家族史(1.3%)，二組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.001)。在子宮切除術(shù)史和子宮卵巢疾病史上，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者與健康對照女性相關(guān)危險因素比較(-)x±s

2.3 rs1801368基因型頻率分布及與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

MAD1L1基因多態(tài)性位點rs1801368在病例組中的基因型分布頻率分別為CC39例(20.63%)，CT81例(42.86%)，TT69例(36.51%)；在對照組中的基因型分布頻率分別為CC63例(30.14%)，CT86例(41.15%)，TT60例(28.71%)，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.066)。但經(jīng)調(diào)整年齡、初潮年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、受教育程度、職業(yè)類型等混雜因素后的多因素分析結(jié)果表明，以野生純合子基因型CC為參照，攜帶突變型TT基因型的女性患乳腺癌的風(fēng)險是野生型的3.40倍(O R=3.40，95%C I：1.29~8.97，P =0.013)，見表3。

2.4 rs1801368基因型分布與乳腺癌患者病理特征間的關(guān)系

結(jié)果顯示M AD1L1多態(tài)性位點rs1801368不同基因型在乳腺癌患者腫瘤病理類型、腫瘤最大直徑、區(qū)域淋巴結(jié)臨床分類、腫瘤遠處轉(zhuǎn)移情況、腫瘤臨床分期、ER、PR、Herb-2、Ki-67受體情況、腫瘤分子分型、腫瘤組織學(xué)分級及危險度評價等臨床病理參數(shù)上差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，結(jié)果見表4。

表3 MAD1L1多態(tài)性位點rs1801368基因型頻率分布及與乳腺癌發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系

表4 MAD1L1多態(tài)性位點rs1801368基因型與乳腺癌患者臨床病理特征分析

3 討論

紡錘體組裝檢驗點作為染色體正確分離的監(jiān)督機制，在染色體沒有完成正確排列之前，能夠通過抑制有絲分裂后期的開始進而確保遺傳物質(zhì)的正確分配[11]。MAD1L1作為紡錘體檢查點功能復(fù)合物的重要組成成員，通過與MAD2L1結(jié)合共同在啟動檢驗點信號中發(fā)揮作用并對其行使轉(zhuǎn)運和激活功能，MAD1L1結(jié)構(gòu)上的異常均可導(dǎo)致紡錘體組裝檢驗點功能失活，進而導(dǎo)致染色體出現(xiàn)非整倍性或癌變[8-11]。此前，Yuan等[12]通過分析包括M AD1L1在內(nèi)的8個SAC基因在12種乳腺癌細(xì)胞株中的RNA和蛋白表達水平發(fā)現(xiàn)大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞存在染色體不穩(wěn)定和紡錘體檢查點功能缺陷現(xiàn)象；Qian等[13]的研究則發(fā)現(xiàn)相比正常乳腺細(xì)胞，MAD1L1蛋白表達水平在癌細(xì)胞核中顯著上調(diào)，并與Herb-2狀態(tài)、腫瘤類型及P53表達有關(guān)；Pujana等[14]進行的一項有關(guān)乳腺癌易感性與中心體功能障礙的網(wǎng)絡(luò)建模研究發(fā)現(xiàn)MAD1L1存在于以BRCA為中心的網(wǎng)絡(luò)模型中，并識別到MAD1L1-BRCA1的內(nèi)源性蛋白復(fù)合物。上述研究結(jié)果均為本研究的假設(shè)即M AD1L1基因上某些位點的突變與女性乳腺癌易感性相關(guān)奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過研究潮汕地區(qū)女性乳腺癌患者及對照人群中M AD1L1rs1801368位點的基因變異情況，結(jié)合生理指標(biāo)、臨床參數(shù)、疾病史、生活方式等指標(biāo)，最終結(jié)果表明，M AD1L1多態(tài)性位點rs1801368堿基的突變與女性患乳腺癌風(fēng)險有關(guān)，攜帶突變型基因型的女性是攜帶野生型基因型女性患病風(fēng)險的3.40倍，提示MAD1L1上rs1801368堿基的突變可能可以作為女性乳腺癌患病風(fēng)險篩查的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果與此前該位點在肺癌及結(jié)直腸癌的中國漢族湖北武漢人群中的研究結(jié)果一致，此前Guo等[10]通過對中國漢族湖北武漢地區(qū)的肺癌及健康對照M AD1L1多態(tài)性位點rs1801368進行基因分型，最終發(fā)現(xiàn)該位點攜帶突變型基因型的人群患肺癌的風(fēng)險是攜帶野生型基因型的1.40倍，相似的結(jié)論亦在同一地域的由結(jié)直腸癌患者和健康對照組成的病例對照研究中得到驗證[6，10]。

通過收集病例對照的人口學(xué)特征、疾病史、人體測量指標(biāo)及生化指標(biāo)等信息進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者相比于健康對照在空腹血糖、收縮壓、舒張壓、心率4項指標(biāo)上數(shù)值均較高；而總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白均較低，提示乳腺癌的發(fā)病還與人體代謝疾病相關(guān)，是一種多因素相互作用的復(fù)雜疾病。流行病學(xué)資料以及臨床研究已證實代謝綜合征與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，其影響機制可能涉及胰島素、胰島素抵抗、內(nèi)源性激素、瘦素、脂聯(lián)素、炎癥因子等多種因子[15-18]。

本研究挑選的位點位于外顯子區(qū)域，據(jù)報道其堿基的突變會引起編碼的氨基酸的改變進而影響紡錘體組裝檢驗點的功能，但尚未見有關(guān)該位點在乳腺癌人群中的報道，本次研究首次揭示了M AD1L1rs1801368基因變異與中國漢族潮汕地區(qū)女性乳腺癌易感性之間的關(guān)系。同時，相比于其他研究，本研究除收集病例對照常規(guī)的人口統(tǒng)計學(xué)特征、生理生育指標(biāo)外，還收集了疾病史、臨床病理指標(biāo)、生化指標(biāo)等相關(guān)信息，資料較為全面，能更好地反映環(huán)境、遺傳變異與乳腺癌易感性之間的關(guān)聯(lián)。但另一方面，本研究亦存在一些局限性，例如前期收集得到的健康對照與乳腺癌病例在職業(yè)類型、受教育程度上存在差異導(dǎo)致與這兩個因素相關(guān)的變量之間亦存在差異，但在分析過程中通過校正排除了這些混雜因素的影響，結(jié)果仍能真實反映rs1801368基因型與乳腺癌患病風(fēng)險之間的關(guān)系。另外，由于本研究目前樣本量偏少，加之腫瘤臨床病理特征分組較多，導(dǎo)致如腫瘤最大直徑大于5cm組及腫瘤分子分型為三陰性等部分組別樣本例數(shù)較少，統(tǒng)計檢驗效率較低，后續(xù)將擴大樣本量，提高檢驗效率。

綜上所述，紡錘體檢驗點基因M AD1L1多態(tài)性位點rs1801368堿基突變與女性乳腺癌發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，攜帶突變型純合子基因型的女性是乳腺癌的易感人群。通過對社區(qū)人群進行該風(fēng)險位點的篩檢進而尋找易感人群，有針對性的加強女性對乳腺相關(guān)疾病知識的了解，同時女性在平時生活中應(yīng)保持良好的生活習(xí)慣，定期對血糖、血壓、血脂進行監(jiān)測，從而預(yù)防乳腺癌的發(fā)生。

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