雞血藤組方提取物的抗腫瘤作用及其機制初探

唐旗羚 曹穎男 徐娟娟 王有娣 賀 彥 鄭江洋 溫梓媚 張素中*

（中山大學新華學院，廣東 廣州 510520）

腫瘤是機體局部組織細胞在基因水平上失去對其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成。現有化療藥物雖然抗癌作用確切，療效顯著，但也存在嚴重不良反應、長期應用易產生腫瘤多重耐藥性的缺陷。而中藥復方可以免疫調節為基礎，逆轉腫瘤免疫逃逸，改善機體功能，抑制腫瘤生長。已有研究表明雞血藤、柴胡、蜈蚣、半夏等中藥材能夠明顯抑制肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等腫瘤組織生長，其中蜈蚣提取物可顯著阻滯宮頸癌細胞周期[1-7]，厚樸酚對人小細胞肺癌細胞具有誘導凋亡作用[8]。本文基于已有研究將雞血藤、厚樸、柴胡、生半夏、蜈蚣進行組方并提取，探索該組方提取物的抗腫瘤作用，并對其機制進行初步研究，為后續藥理研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：人肝癌HepG2細胞、人肺癌A549細胞、鼻咽癌CNE-2Z細胞、骨肉瘤143B細胞、急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞。

1.1.2 儀器與試劑：CCK-8試劑、二甲基亞砜、RPMI-1640培養基、IMDM培養基、胰酶、胎牛血清、倒置熒光顯微鏡、Hoechst 33258熒光染色檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8法測定雞血藤組方提取物對各腫瘤細胞增殖作用的影響：收集對數生長期的HepG2、A549、143B、CNE-2Z、HL-60細胞，接種于96孔板，每孔加90 μL的細胞懸液，在37 ℃條件下孵育。每孔對應加入0.0044～17.00 mg/mL不同梯度濃度的雞血藤組方提取物10 μL，置于37 ℃培養箱中孵育72 h，同時設立陰性對照組和空白對照組。加入100 μL含10% CCK-8的培養基置于37 ℃培養箱中孵育，酶標儀450 nm處檢測各孔的吸光度（A）值。采用Graph Pad Prism 5軟件分析雞血藤組方提取物在72 h的IC50值并作圖。腫瘤細胞生長抑制率%＝[（受試物吸光度值-陰性對照吸光度值）/（陰性對照吸光度值-空白對照吸光度值）]×100%。

1.2.2 Hoechst33258染色法觀察HepG2細胞核的形態學變化：取對數生長期的HepG2細胞，以每孔500 μL的體積接種于24孔培養板中，細胞貼壁后加入0.459 mg/mL濃度的雞血藤組方提取物，置于37 ℃培養箱中孵育48 h，4%的多聚甲醛液固定。PBS洗滌。加入Hoechest 33258染色液500 μL，室溫避光染色后PBS洗滌，避光風干，倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結 果

2.1 雞血藤組方提取物對各腫瘤細胞增殖作用的影響：CCK-8法測定結果顯示，與空白對照相比，經各濃度雞血藤組方提取物作用后的肝癌HepG2細胞、肺癌A549細胞、鼻咽癌CNE-2Z細胞、骨肉瘤143B細胞、急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞，其增殖均受到不同程度的抑制，并且雞血藤組方提取物對上述5種細胞增殖的抑制作用呈現一定的濃度依賴性，見圖1。經Graphpad Prism 5軟件分析，雞血藤組方提取物干預HepG2、A549、CNE-2Z、143B、HL-60細胞72 h的IC50值分別為0.54、10.04、1.59、0.86、3.37mg/mL，最大抑制率分別為92.06%、98.74%、99.99%、97.44%、77.78%，見表1。

2.2 雞血藤組方提取物對HepG2細胞凋亡形態學變化的影響：Hoechst 33258細胞核染色結果顯示，空白對照組HepG2細胞多數呈現染色質均勻分布等活細胞特征。與空白對照組相比，雞血藤組方提取物作用48 h的HepG2細胞，其凋亡細胞數明顯增多，呈現染色質凝集、核濃染等典型特征，提示雞血藤組方提取物可誘導HepG2細胞凋亡，見圖2。

圖1 雞血藤組方提取物對各腫瘤細胞株增殖抑制作用的IC50值

表1 不同濃度雞血藤組方提取物對不同腫瘤細胞增殖的影響

圖2 Hoechst 33258染色觀察細胞核的形態學變化

3 討 論

在腫瘤的中醫治療中，常用的治療法有扶正培本法、清熱解毒法、活血化瘀法、利濕逐水法、軟堅散結法等[9]。本文雞血藤、厚樸、柴胡、生半夏、蜈蚣組方中藥材具有疏肝理氣、解毒散結作用而產生扶正抗癌作用，研究結果表明該組方提取物在體外對肝癌HepG2細胞 、肺癌A549細胞、鼻咽癌CNE-2Z細胞、骨肉瘤143B細胞以及急性早幼粒細胞白血病HL-60細胞均產生具有濃度依賴性的抑制增殖作用，Hoechst 33258染色結果提示這可能與該組方提取物促進腫瘤細胞凋亡相關。已有研究表明，中草藥及中藥復方通過調控多重藥耐藥基因蛋白的表達，產生有效逆轉腫瘤多重耐藥的作用，可開發為腫瘤多重耐藥基因MDR的逆轉劑，現已成為研究熱點[10]。李冬梅[11]的研究顯示，扶正解毒中藥復方可以逆轉乳腺癌多藥耐藥的基因表達，改善患者免疫功能，提高化療療效。P-糖蛋白是多重耐藥基因MDR1的蛋白產物，通過消耗ATP將藥物從腫瘤細胞外排，減少腫瘤細胞內有效藥物濃度，從而導致嚴重的腫瘤多藥耐藥。基于本文已研究雞血藤組方的抗腫瘤作用及機制，可進一步研究其對MDR基因及其相關蛋白產物表達的影響，以期為中藥組方在腫瘤治療領域發揮重要作用提供理論基礎。

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