虎杖苷對動脈粥樣硬化ApoE—/—小鼠血管功能的影響

林園園

[摘要]目的 研究虎杖苷對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠血管功能的影響。方法 選取高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠16只，制備動脈粥樣硬化小鼠模型。將造模后的小鼠隨機分為模型組、實驗組，每組8只；且隨機抽取8只SPF級C57/BL6小鼠為對照組。實驗組采用虎杖苷進行16周的治療，模型組和對照組不做治療。采集治療前后各組小鼠的血清，用酶聯免疫吸附試驗檢測總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-c）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、超敏C-反應蛋白（hs-CRP）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、高密度脂蛋白（HDL-c）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細胞介素-10（IL-10）。治療周期結束后，制作小鼠動脈血管組織切片，采用油紅O染色法，比較各組小鼠動脈血管的斑塊面積比。結果 模型組和實驗組治療前的TC、TG、LDL-c、TNF-α、IL-1β、IL-6、hs-CRP、T-AOC、MDA、MCP-1水平高于對照組，HDL-c、SOD、IL-10水平低于對照組（P<0.05）。實驗組小鼠治療后的TC、TG、LDL-c、TNF-α、IL-1β、IL-6、hs-CRP、T-AOC、MDA、MCP-1水平低于模型組，HDL-c、SOD、IL-10水平高于模型組（P<0.05），且實驗組動脈血管斑塊面積顯著減少（P<0.05）。結論 虎杖苷對動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠有一定的緩解和預防作用，能有效降低血脂，降低炎性細胞因子、趨化因子，增加血清免疫功能。

[關鍵詞]動脈粥樣硬化；虎杖苷；血脂；趨化因子；血管功能

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）4（b）-0021-04

Influence of Polydatin on vascular function in the ApoE-/- mice with atherosclerosis

LIN Yuan-yuan

Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hubei Province，Wuhan 430074，China

[Abstract]Objective To study the influence of Polydatin on vascular function in the ApoE-/- mice with atherosclerosis.Methods To prepare the mouse model with therosclerosis，16 ApoE-/- mice with high fat diet were selected.The model mice were randomly divided into the model group and the experimental group，and 8 normal mice were chosen as the control group.The experimental group was treated with Polydatin for 16 weeks，while the model group and the control group was not treated.After and before the treatment，the serum was collected，and the triglyceride （TG），low density lipoprotein （LDL-c），tumor necrosis factor α （TNF-α），interleukin 1β （IL-1β），interleukin 6 （IL-6），high sensitive C-reactive protein （hs-CRP），total antioxidant capacity （T-AOC），malondialdehyde （MDA），monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1），high density lipoprotein （HDL-c），superoxide dismutase （SOD） and interleukin 10 （IL-10） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）.The tissue sections of mouse arterial blood vessels were made and the plaque area ratio of arterial blood vessels in each group was compared by oil red O staining.The plaque area ratio of arterial vessels in each group was compared.Results Before the treatment，compared with the control group，the level of TC，TG，LDL-c，TNF-α，IL-1β，IL-6，hs-CRP，T-AOC，MDA，MCP-1 in serum from the model group and the experimental group were significantly increased （P<0.05）；the level of HDL-c，SOD and IL-10 of that were significantly reduced （P<0.05）.After the treatment，compared with the model group，the level of TC，TG，LDL-c，TNF-α，IL-1β，IL-6，hs-CRP，T-AOC，MDA and MCP-1 in serum from the experimental group were significantly lower，and the HDL-c，SOD and IL-10 increased significantly （P<0.05）.And the area of arterial plaque decreased significantly （P<0.05）.Conclusion The Polydatin may relieve and prevent certain effect on atherosclerosis in ApoE-/- mice，reduce blood fat，inflammatory cytokines，chemokines，and increase serum immune function.

[Key words]Atherosclerosis；Polydatin；Blood lipids；Chemokines；Vascular function

心腦血管疾病是發病率較高的疾病。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是導致心臟病、腦卒中等心腦血管疾病的主要原因[1]，其病理基礎為脂質代謝紊亂、膽固醇和三酰甘油（TG）的沉積以及血管的慢性炎癥病變[2]。過量的脂質引起細胞的凋亡，從而釋放出脂質，形成粥樣斑塊[3-4]。在我國，隨著人口比例的老齡化趨勢，心臟病、腦卒中等疾病的發病率逐年上升，對人們的生命財產造成損失[5]?；⒄溶眨≒olydatin）的主要成分為白黎蘆醇和葡萄糖的結合產物，主要從蓼科蓼屬虎杖的根莖中提取，具有強心、改善微循環的功效[6-8]。本研究以ApoE-/-小鼠為對象，以高脂食物喂養，構建AS模型，采用虎杖苷治療，旨在觀察虎杖苷對AS ApoE-/-小鼠血管功能的影響，探討虎杖苷對患有AS病癥小鼠的影響。

1對象與方法

1.1實驗對象

ApoE-/-小鼠品系C57/BL6，（購于北京華阜康生物科技股份有限公司），無處理的SPF級C57/BL6小鼠與ApoE-/-小鼠無遺傳差異，體重（19.3±0.6）g，飼養溫度為（25±1）℃。

1.2試劑和儀器

虎杖苷（Sigma，產品編號 15721），膽固醇（Sigma，產品編號 200-353-2），Leica 1900 冰凍切片機（德國 Leica），酶標儀（美國 Bio-Tek）。

1.3模型建立和分組

本實驗分為對照組、模型組、實驗組。實驗共有SPF級C57/BL6小鼠8只，ApoE-/-小鼠16只。隨機抽取的16只ApoE-/-小鼠，用普通配方飼料暫養1周后，投喂高脂配方飼料（含1.5%膽固醇，15.0%脂肪酸，83.5%普通飼料），連續喂養12周，隨機選取造模成功的8只ApoE-/-小鼠組成實驗組，以虎杖苷藥物治療，每天灌胃0.2 g/kg；剩下8只小鼠不做治療，組成模型組。隨機選取8只無遺傳差異C57/BL6小鼠作為對照組，投喂普通飼料，并給予同等劑量的生理鹽水，治療持續16周。

1.4檢測指標

測定治療前后每組小鼠血清中的總膽固醇（TC）、TG、低密度脂蛋白（LDL-c）、腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細胞介素1（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、超敏C-反應蛋白（hs-CRP）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）、高密度脂蛋白（HDL-c）、超氧化物歧化酶（SOD）、白細胞介素-10（IL-10）等各項指標，采樣前禁食12 h，眼眶取血，離心分離后，取上清液，按照ELISA試劑盒（購買于南京建成生物工程研究所）說明書的步驟檢測以上指標。

各組給藥結束后，用乙醚麻醉小鼠后開胸，以0.01 mol/L的PBS液經心室灌流，取胸腔主動脈根部，制作80張冷凍切片，每隔5張進行油紅O染色，并做面積變量分析，用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics USA）軟件分析斑塊面積，并計算斑塊占血管面積比。

本文對動物的處理均符合湖北省中醫院所制訂的有關實驗動物保護和使用的指南，并經本單位實驗動物倫理委員會批準。

1.5統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，計數資料以率表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1小鼠血清中脂質含量變化的比較

模型組和實驗組治療前的TC、TG、LDL-c水平均高于對照組，HDL-c水平低于對照組（P<0.05）。模型組治療后的TC、TG、LDL-c水平均高于治療前，HDL-c水平低于治療前（P<0.05）。實驗組治療后的TC、TG、LDL-c水平均低于模型組，HDL-c水平高于模型組（P<0.05）（表1）。

表1 小鼠血清中脂質含量的比較（g/L，x±s）

與同組治療前比較，▲P<0.05；與對照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，#P<0.05

2.2各組小鼠炎性細胞因子和免疫能力的比較

模型組和實驗組小鼠治療前的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于對照組，IL-10水平低于對照組（P<0.05）。模型組治療后的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于治療前，IL-10水平低于治療前（P<0.05）；實驗組治療后的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均低于模型組（P<0.05），IL-10水平高于模型組（P<0.05）（表2）。

表2 各組小鼠血清的炎性細胞因子和免疫能力的比較（ng/L，x±s）

與同組治療前比較，▲P<0.05；與對照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，#P<0.05

2.3血清抗氧化能力的比較

與對照組治療前比較，模型組和實驗組治療前的T-AOC和MDA含量均高于對照組，SOD低于對照組（P<0.05）。模型組小鼠治療后的T-AOC和MDA含量均高于治療前，SOD低于治療前（P<0.05）。實驗組治療后的MDA低于模型組（P<0.05），SOD高于模型組（P<0.05）（表3）。

表3 各組小鼠血清抗氧化能力的比較（x±s）

與同組治療前比較，▲P<0.05；與對照組治療前比較，*P<0.05；與模型組治療后比較，#P<0.05

2.4各組小鼠血清中黏附分子的比較

與對照組治療前比較，模型組和實驗組小鼠治療前的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平高于對照組（P<0.05）。模型組治療后的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平均高于治療前（P<0.05）。治實驗組治療后的MCP-1、ICAM-1、VCAM-1水平低于模型組（P<0.05）（表4）。

2.5各組小鼠血清中趨化因子的比較

模型組和實驗組治療前的PCT和hs-CRP水平高于對照組（P<0.05）；模型組治療后的PCT和hs-CRP水平高于治療前（P<0.05）。實驗組治療后的PCT、hs-CRP水平低于模型組（P<0.05）（表5）。

2.6小鼠動脈斑塊的比較

實驗組治療后的主動脈斑塊面積低于模型組（P<0.05）（表6）。

表6 各組小鼠主動脈斑塊的比較（x±s）

與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3討論

動脈血管粥樣硬化的誘因是多方面的，最主要的誘因是三酰甘油代謝紊亂，在動脈血管粥樣硬化炎性病變的初期，內皮功能損傷，進而刺激機體產生炎性細胞因子（IL-6、TNF-α、IL-1β等）、黏附分子（如ICAM-1和VCAM-1等）、趨化因子（如MCP-1）等[9-10]。投喂高脂食物的ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量均顯著升高。在虎杖苷的作用下，ApoE-/-小鼠血清中TC、TG、HDL-c和LDL-c含量均顯著下降。血管的炎癥反應可能是誘導AS斑塊的主要原因[11]。炎癥細胞因子能損傷內皮，促進蛋白溶解，降低其修復作用，增加斑塊的不穩定性。當小鼠血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6含量較高時，可造成血管內膜損傷、血管痙攣，并導致斑塊脫落[12]。TNF-α是一種非糖基化轉膜蛋白，可介導炎癥反應，參與內皮細胞損傷的活動，并聚集炎性細胞，促進炎性遞質的釋放[13]。TNF-α水平越高，則AS病癥越嚴重。周暢等[14]用虎杖苷灌胃動脈粥樣硬化小鼠后，顯著提高了小鼠血管的抗氧化能力。本研究中，投喂高脂食物的ApoE-/-小鼠血清中hs-CRP、TNF-α和IL-6水平均顯著升高，而以虎杖苷治療后，其含量均顯著下降，提示虎杖苷對患有AS的小鼠有降脂和降低炎癥反應的作用。SOD能清除自由基，抗氧化，降低脂質過氧化物的含量[15]。模型組小鼠血清中T-AOC和MDA顯著升高，SOD含量則顯著降低，可能是由于體內過多的自由基消耗了SOD。以虎杖苷治療后，SOD含量升高，T-AOC和MDA含量降低，顯著提高抗氧化能力，內皮功能顯著提高。趨化因子MCP-1與AS的形成以及斑塊的穩定性息息相關，可為動脈粥樣硬化的診斷依據[16-18]。本研究中，實驗組小鼠血清中MCP-1含量顯著降低，動脈粥樣硬化的程度逐漸緩解。在AS初期，吸煙、高血壓、高血脂等刺激可以激發內皮損傷和功能障礙，并激發炎性反應。內皮細胞激活導致ICAM-1和VCAM-1等黏附因子增加。ICAM-1和VCAM-1調節白細胞在血管中的黏附能力，更加促進內皮的損傷。在正常血管中，ICAM-1和VCAM-1的含量非常低，而在AS形成的早期，ICAM-1和VCAM-1含量升高，與AS的病變程度有關[19-20]。實驗組小鼠經過虎杖苷治療后，ICAM-1和VCAM-1含量顯著降低，有效緩解內皮功能的損傷。

綜上所述，虎杖苷通過降低血管中脂質的含量，降低炎性細胞因子水平，調節黏附因子和趨化分子，達到對脂質代謝紊亂造成AS的小鼠降血脂和降低血管炎癥反應的作用，提高內皮血管功能，有效減緩甚至防止AS的發展。

[參考文獻]

[1]Lusis AJ.Atherosclerosis[J].Nature，2000，407（6801）：233-241.

[2]Rosales C，Davidson WS，Gillard BK，et al.Speciated high-density lipoprotein biogenesis and functionality[J].Curr Athe-roscler Rep，2016，18（5）：1-8.

[3]Twigg MW，Freestone K，Homervanniasinkam S，et al.The LOX-1 scavenger receptor and its implications in the treatment of vascular disease[J].Cardiol Res Pract，2012，2012（4）：632408.

[4]Shashkin P，Dragulev B，Ley K.Macrophage differentiation to foam cells[J].Curr Pharm Des，2005，11（23）：3061.

[5]祝曉慶，楊潔，邵娟，等.復方總黃酮對ApoE基因敲除小鼠動脈粥樣硬化的影響[J].中國藥理學通報，2017，33（2）：180-184.

[6]夏婷婷，楊珺超，劉清源，等.虎杖藥理作用研究進展[J].浙江中西醫結合雜志，2016，26（3）：294-297.

[7]Kullo IJ，Rooke TW.CLINICAL PRACTICE.Peripheral artery disease[J].N Engl J Med，2016，374（9）：861-871.

[8]Ming D，Ding W，Liao Y，et al.Polydatin prevents hypertrophy in phenylephrine induced neonatal mouse cardiomyocytes and pressure-overload mouse models[J].Eur J Pharmacol，2015，746：186-197.

[9]Libby P.History of discovery：inflammation in atherosclerosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（9）：2045.

[10]Deshmane SL，Kremlev S，Amini S，et al.Monocyte chemoattractant protein-1 （MCP-1）：an overview[J].J Interferon Cytokine Res，2009，29（6）：313.

[11]吳世陶，王建平，楊期東，等.Annexin A1、Lp-PLA2、Bax與人頸動脈粥樣硬化斑塊的關系[J].中華神經醫學雜志，2012，11（10）：1010-1014.

[12]王秀艷，袁建新，王軼瑾，等.血清超敏C反應蛋白與急性腦梗死的相關性研究[J].臨床神經病學雜志，2006，19（3）：210-212.

[13]艾斯，鄭健，林青，等.腎康靈調控系膜細胞炎性反應因子的機制研究[J].世界中醫藥，2015，（2）：236-242.

[14]周暢，胡婷婷，王志剛，等.虎杖苷通過降血脂抗ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的作用[J].安徽醫藥，2016，20（12）：2226-2229.

[15]杜平，曹鄧晗.高膽固醇血癥患者氧化指標、炎癥因子及血管內皮功能的變化及意義[J].海南醫學院學報，2016， 22（23）：2818-2821.

[16]Hartung D，Petrov A，Haider N，et al.Radiolabeled Monocyte Chemotactic Protein 1 for the detection of inflammation in experimental atherosclerosis[J].J Nucl Med，2007，48（11）：1816-1821.

[17]Moreno S，Alvarez B，Poderoso T，et al.Porcine monocyte subsets differ in the expression of CCR2 and in their responsiveness to CCL2[J].Vet Res，2010，41（5）：76.

[18]Kruth HS，Anzinger JJ，Chang J，et al.Native low-density lipoprotein uptake by macrophage colony-stimulating factor differentiated macrophages is mediated by macropinocytosis and micropinocytosis[J].Cytokine，2009，48（1-2）：2022.

[19]Singh RJR，Mason JC，Lidington EA，et al.Cytokine stimulated vascular cell adhesion molecule-1 （VCAM-1） ectodomain release is regulated by TIMP-3[J].Cardiovasc Res，2005，67（1）：39-49.

[20]Davies MJ，Gordon JL，Gearing AJ，et al.The expression of the adhesion molecules ICAM-1，VCAM-1，PECAM，and E-selectin in human atherosclerosis[J].J Pathol，1993，171（3）：223.

（收稿日期：2017-12-27 本文編輯：祁海文）