沉默Bcl2、Bak1基因表達對成骨肉瘤MG-63細胞增殖及成骨能力的影響

黃宏興，柴爽，黃紅，萬雷，王吉利(廣州中醫(yī)藥大學附屬骨傷科醫(yī)院，廣州5040；廣州中醫(yī)藥大學)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)損壞，導致骨脆性增加，易于發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。近年來越來越多的研究認為，成骨細胞凋亡及其功能異常在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病中具有重要作用[1～5]。細胞凋亡途徑主要包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑，內(nèi)源性途徑主要通過Bcl2家族蛋白調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性實現(xiàn)細胞凋亡，其中Bcl2屬于抗凋亡蛋白、Bak1屬于促凋亡蛋白[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥患者椎板旁骨骼肌線粒體通透轉(zhuǎn)換孔活性增強、股骨粗隆間部松質(zhì)骨Bak1表達明顯升高，Bcl2表達則明顯降低[7]。成骨細胞具有活躍的分泌功能，能合成和分泌骨基質(zhì)中的多種有機成分，對骨生長有重要作用。研究表明，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者以及脊髓損傷后骨質(zhì)疏松動物模型來源的成骨細胞活力均下降[8]。2017年3～6月，本研究采用腺病毒介導Bcl2、Bak1 shRNA單獨或共轉(zhuǎn)染成骨肉瘤MG-63細胞，并觀察其對細胞增殖及成骨功能的影響，以期為進一步研究成骨細胞凋亡在骨質(zhì)疏松癥中的作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：MG-63細胞由中國科學院上海細胞所細胞庫提供。重組腺病毒載體：參照本課題組前期研究設(shè)計并篩選出沉默效率最高的Bcl2、Bak1 shRNA，并分別構(gòu)建重組腺病毒載體。主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Pen/Strep購自美國Gibco公司，噻唑藍(MTT)檢測試劑盒購自美國Sigma公司，堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，抗骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4)抗體、抗骨橋蛋白(OPN)抗體、抗Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)抗體、抗TNF-α抗體均購自美國Abcam公司，羊抗兔二抗購自美國Jackson公司。主要儀器：細胞培養(yǎng)箱購自法國NaPCO公司，酶標儀購自美國Thermo公司，Aria Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司，Mini-PROTEAN Tetra電泳儀、Mini-Trans Blot蛋白轉(zhuǎn)印儀、ChemiDoc MP凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細胞分組處理 收集對數(shù)生長期MG-63細胞，制成密度為1×104/mL的細胞懸液。將細胞懸液接種于96孔板，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)24 h。將細胞隨機分為shBcl2組、shBak1組、共轉(zhuǎn)染組和空白對照組，每組設(shè)置3個復孔。shBcl2組、shBak1組、空白對照組分別單獨轉(zhuǎn)染shBcl2、shBak1重組腺病毒和空載腺病毒，感染復數(shù)(MOI)=50，共轉(zhuǎn)染組采用同樣的方法共轉(zhuǎn)染shBcl2、shBak1重組腺病毒。

1.3 相關(guān)指標觀察

1.3.1 細胞增殖能力 采用MTT法。取1.2中轉(zhuǎn)染48 h的各組細胞，棄舊培養(yǎng)基補充新鮮培養(yǎng)基，同時每孔分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，于細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μL DMSO，室溫搖床低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。于酶標儀上測定490 nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞增殖率。細胞增殖率=A實驗孔/A正常對照孔×100%。

1.3.2 ALP活性 采用對硝基苯磷酸鹽法。收集對數(shù)生長期的MG-63細胞，制成密度為1×105/mL的細胞懸液。將細胞懸液接種于6孔板中，每孔2 mL。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，參照1.2的方法進行分組處理。各組轉(zhuǎn)染48 h后棄舊培養(yǎng)基，消化收集細胞，提取細胞總蛋白，考馬斯亮藍蛋白定量。按照ALP活性檢測試劑盒說明書進行操作，于酶標儀上測定405 nm或400～415 nm波長處的A值。由標準曲線計算的A值×稀釋倍數(shù)(2.5)/蛋白濃度(μg/μL)計算ALP活性。

1.3.3 成骨相關(guān)蛋白表達 采用Western blotting法。各組轉(zhuǎn)染48 h后，棄舊培養(yǎng)基，消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清。預冷PBS洗滌細胞沉淀2次，向細胞沉淀中加入20 μL RIPA(含有0.2 μL PMSF)裂解液，置于冰上并用槍頭吹打，使細胞充分裂解30 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，小心轉(zhuǎn)移上清到新的預冷EP管中，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩SA法測定總蛋白含量，計算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量，在蛋白標本中加入適當體積的蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，分別加入BMP4、OPN、Runx2、TNF-α一抗，4 ℃孵育過夜。TBST室溫下脫色搖床上洗3次(每次5 min)，加入二抗(1∶3 000)，室溫下孵育30 min。ECL法顯色，圖像處理軟件分析各條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值計算蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞增殖率、ALP活性比較 shBcl2組細胞增殖率、ALP活性均低于空白對照組，shBak1組細胞增殖率、ALP活性均高于空白對照組(P均<0.01)?？瞻讓φ战M與共轉(zhuǎn)染組細胞增殖率、ALP活性比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。見表1。

表1 各組細胞增殖率、ALP活性比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01；與shBcl2組比較，#P<0.05，▲P<0.01；與shBak1組比較，△P<0.01。

2.2 各組成骨相關(guān)蛋白相對表達量比較 shBcl2組細胞BMP4、OPN、Runx2相對表達量均低于空白對照組，TNF-α相對表達量高于空白對照組(P均<0.05)。shBak1組細胞BMP4、OPN、Runx2相對表達量均高于空白對照組，TNF-α相對表達量低于空白對照組(P均<0.01)?？瞻讓φ战M與共轉(zhuǎn)染組細胞BMP4、OPN、Runx2、TNF-α相對表達量比較均無統(tǒng)計學差異(P均>0.05)。見表2。

表2 各組成骨相關(guān)蛋白相對表達量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.01，#P<0.05；與shBcl2組比較，▲P<0.01；與shBak1組比較，△P<0.01。

3 討論

Bcl2家族蛋白根據(jù)所含功能域的不同可分為三大類：抗凋亡亞家族(Bcl2、Bcl-XL、Mcl-1等)，促凋亡亞家族(Bax、Bak)和僅含BH3結(jié)構(gòu)域的BH3-only亞家族(Bid、Bad、Bim等)，家族成員之間可形成同源二聚體和異源二聚體，其中抗凋亡與促凋亡成員之間形成的異源二聚體可抑制促凋亡蛋白的生物活性[9]，它們之間的平衡決定了細胞對凋亡刺激的敏感性[10]。早期研究多認為，Bax對抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL具有較強親和力，而Bak1對抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-XL具有較強的親和力[11,12]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Bak1蛋白與Bcl2的結(jié)合比其與Bcl-XL的結(jié)合更緊密，而且Bcl2下調(diào)能誘導Bak依賴性細胞凋亡[13]。在凋亡刺激誘導下，BH3-only亞家族蛋白被激活并轉(zhuǎn)移到線粒體上，與抗凋亡蛋白(Bcl2、Bcl-XL)結(jié)合，釋放促凋亡蛋白(Bax、Bak)，或直接激活促凋亡蛋白(Bax、Bak)，在線粒體上形成蛋白孔道，導致細胞色素C從線粒體中釋放而誘導細胞凋亡[14]。

為進一步研究細胞凋亡對骨形成的影響，本課題組設(shè)計并篩選出具備最佳沉默效率的Bcl2、Bak1 shRNA，構(gòu)建重組腺病毒載體。本研究采用shBcl2、shBak1重組腺病毒載體單獨或共轉(zhuǎn)染MG-63細胞，發(fā)現(xiàn)shBcl2組細胞增殖率、成骨細胞的早期分化標志ALP活性均低于空白對照組；shBak1組細胞增殖率、ALP活性均高于空白對照組；這可能與RNA干擾使Bcl2表達減少，Bak1更多地形成同源二聚體，從而誘導成骨細胞內(nèi)源性凋亡有關(guān)。本研究中空白對照組與共轉(zhuǎn)染組細胞增殖率、ALP活性比較均無統(tǒng)計學差異，在一定程度上說明在成骨細胞中干擾Bak1可以抵消干擾Bcl2的作用，與其在淋巴細胞[12]中的相關(guān)研究結(jié)果一致。

成骨細胞的主要功能包括產(chǎn)生膠原纖維和無定形基質(zhì)形成類骨質(zhì)，分泌骨鈣蛋白、骨黏連蛋白和骨唾液酸蛋白等非膠原蛋白，促進骨組織的礦化。成骨細胞表面存在多種骨吸收刺激因子的受體，能分泌一些細胞因子，調(diào)節(jié)骨組織形成和吸收。BMP4對于骨骼的發(fā)育和重塑至關(guān)重要[16]。OPN作為成骨細胞成熟階段的特異性標志物之一[16]，在骨改建中維持骨基質(zhì)礦化和骨吸收平衡，介導骨組織細胞與骨基質(zhì)間的橋接，可以促進骨礦化[17]。Runx2在成骨分化過程中具有關(guān)鍵性作用，能夠通過調(diào)控成骨細胞特異性細胞外基質(zhì)蛋白基因表達和成骨細胞周期，參與成骨細胞的分化過程[18]。以上四種蛋白均與成骨細胞成熟分化及骨形成密切相關(guān)。TNF-α是一種炎性細胞因子，能直接作用于破骨前體細胞，并促進其分化；還可通過誘導成骨細胞表達RANKL間接促進破骨細胞分化，增強骨吸收，對成骨細胞功能也有直接影響。本研究結(jié)果顯示，shBcl2重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染可降低細胞BMP4、OPN、Runx2蛋白相對表達量，提高TNF-α相對表達量，shBak1重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染則產(chǎn)生相反作用；說明沉默Bcl2不僅可促進成骨細胞凋亡，還可影響成骨細胞成熟及分化。本研究中共轉(zhuǎn)染組各成骨相關(guān)蛋白表達與空白對照組比較均無統(tǒng)計學差異，進一步說明在成骨細胞中下調(diào)Bak1可以抵消下調(diào)Bcl2的作用，消除下調(diào)Bcl2誘導細胞凋亡對成骨相關(guān)蛋白的影響。

綜上所述，沉默Bcl2基因表達可抑制MG-63細胞增殖及成骨能力，沉默Bak1基因則具有相反的作用；Bcl2與Bak1共同參與細胞凋亡及成骨過程。本研究為從成骨細胞凋亡角度干預骨代謝、防治骨質(zhì)疏松癥提供了新的實驗方法和思路。

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