RAAS相關microRNA基因多態性與高血壓并發糖尿病的關系

薛強，黃東宗，周奕丞，武英，李云，時瑞霞，楊青(華北理工大學，河北唐山0600； 959部隊； 遵義醫學院珠海校區；唐山市開灤總醫院)

研究發現，高血壓患者同時患有糖尿病的概率明顯高于一般人群[1]，而糖尿病人群高血壓的患病率是一般人群的2～3倍[2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)具有調節水、電解質平衡等重要作用，高血壓患者通常伴有RAAS活性增加[3]，而RAAS活性過高與微循環改變具有協同作用，可影響胰島素主要分泌器官和胰島素敏感性，同時損害細胞對胰島素信號的反應[4]， 進而影響血糖代謝。高血壓與糖尿病均存在發病家庭聚集現象，提示兩種病可能受某些遺傳因素的影響。本文通過觀察高血壓并發糖尿病患者RAAS相關微小核糖核酸(miRNA)基因多態性，分析高血壓并發糖尿病的易感基因，探討高血壓并發糖尿病的機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月～2017年3月唐山市開灤總醫院收治的高血壓并發糖尿病患者511例(觀察組)及單純高血壓患者476例(對照組)，均依據《中國高血壓防治指南》(2010版)及WHO糖尿病診斷標準(1999年)明確診斷。排除患有嚴重心、肺、腦、腎疾病及腫瘤患者。觀察組男408例、女103例，年齡(62.61±7.98)歲；對照組男305例、女171例，年齡(63.46±8.10)歲；組間比較P均>0.05。觀察組空腹血糖(FPG)、低密度脂蛋白(LDL)、TG、TC、BMI均高于對照組(P均<0.05)，兩組收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、高密度脂蛋白(HDL)比較P均>0.05。見表1。

表1 兩組一般資料比較

注：與對照組比較，*P<0.05。

1.2 基因位點選擇 利用mirWALK以及HMDD數據庫提供的miRNA信息，結合Pubmed等數據庫收錄的分子生物信息學方面既往文獻，篩選在中國人群具有較高突變頻率且與高血壓及糖尿病相關或RAAS相關的miRNA；利用miRNA靶基因預測軟件miRANDA、TargetScan及ensemble基因組瀏覽器預測和篩選RASS相關miRNA靶基因結合區內最小等位基因頻率MAF≥5%，且Hardy-Weinberg平衡檢驗P>0.01的所有單核苷酸多態性(SNPs)，最終篩選出可能與高血壓并發糖尿病相關的基因及位點，即miR-124相關CYP11B2基因rs531564位點、miR-20相關INSR基因rs1366600位點。

1.3 基因多態性檢測 兩組均于清晨抽取空腹狀態下肘靜脈血6 mL，EDTA抗凝，常溫3 500 r/min離心10 min，取上清。利用小量全血基因組DNA提取試劑盒提取全血DNA，測定DNA濃度，稀釋至10 μg/L，- 20 ℃留存待用。將留存DNA樣本恢復至室溫，首先進行PCR引物擴增，根據擴增產物配置不同濃度瓊脂糖凝膠，加入TBE緩沖液，加熱至完全溶解，取出溶液冷卻至60 ℃左右，加入1.5 μL溴化乙錠至濃度為0.5 μg/mL，混勻倒膜后待其冷卻凝固，完成瓊脂糖凝膠制作。應用Taqman熒光探針法進行基因分型，miR-124相關CYP11B2基因rs531564位點引物序列：上游引物：5′-GAGGGGAG-GGGTCTGGAG-3′；下游引物：5′-GCCCAGAGAAAA-ATCTGCACACGCGTCGACCCATTTCTCGGGGACCC-TT-3′；miR-20相關INSR基因rs136600位點引物序列：上游引物：5′-CTAGCTAGCTCCTTGACACCTTAGGCTC-3′；下游引物： 5′-ACGCGTCGACCCATTTCTC-GGGGACCCTT-3′。加熱DNA至95 ℃保持15 s 使其變性，60 ℃保持1 min使引物和探針退火及延伸，共40個循環。使用凝膠電泳成像系統在合適的曝光條件下顯影并照相保存圖膠留存觀察結果。

2 結果

兩組均進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，各位點基因頻率處于遺傳平衡狀態，樣本具有群體代表性。兩組miR-124 CYP11B2基因rs531564位點三種基因型GG、GC、CC分布頻率及G、C等位基因分布頻率比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，見表2。兩組miR-20 相關INSR基因rs1366600位點三種基因型TT、TC、CC分布頻率及T、C等位基因分布頻率比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表3。

表2 兩組miR-124相關CYP11B2基因rs531564位點基因型及等位基因分布比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05。

表3 兩組miR-20相關INSR基因rs1366600位點基因型及等位基因分布[例(%)]

3 討論

高血壓、糖尿病作為心腦血管疾病的主要危險因素，二者存在一定的發病聚集性[5]，罹患此兩種疾病可使心腦血管疾病發病風險進一步增加。RAAS主要由腎素、血管緊張素、血管緊張素轉換酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ及醛固酮等構成[6]，該系統在高血壓及糖尿病發生發展中的作用越來越受到重視。高血壓患者常伴有RAAS活性增加，RAAS持續激活是導致高血壓的一個重要因素[7]，RAAS活性越高，FBG水平越高，患糖尿病的風險越大[8]。

miRNA是一種內源性非編碼RNA，通過與靶基因的3′非翻譯區(3′-UTR)結合，直接降解靶基因mRNA或抑制其靶基因的翻譯過程，進而在轉錄后水平發揮基因調控作用。miRNA調節著人類約1/3的蛋白質編碼基因。研究發現，miR-124不僅與RAAS激活相關[9]，其相關rs531564位點與消化系統惡性腫瘤、宮頸癌發病的相關性近年亦被關注。既往研究證實，CYP11B2基因在高血壓患者中呈多態性分布，已成為原發性高血壓的候選基因[10]。CYP11B2基因相關位點與RAAS激活同樣存在關聯[11]。最近一個關于中國漢族人群的研究發現，miR-124影響中國人群代謝綜合征的發生，miR-124a rs531564位點CC基因型表達成熟miR-124a的數量較GG基因型少20%，rs531564位點G等位基因導致成熟miR-124過表達，推測miR-124基因rs531564位點多態性可能與中國人群代謝綜合征有關[12,13]。

Ober等[13]最早報道INSR基因變異可增加糖尿病的發生風險。INSR基因rs1799817位點少見的T等位基因為南印度人2型糖尿病的保護因素[14]。miR-20作為參與調控INSR的基因位點[15]，其rs1366600位點位于miR-20的3′-UTR區域[16]。有報道顯示，攜帶rs1366600位點C等位基因的孕婦餐后2 h的血糖水平更高，提示該位點的C等位基因可能與糖尿病發病相關[17]。目前關于rs1366600位點多態性與高血壓并發糖尿病的關系未見報道。

本研究結果顯示，高血壓并發糖尿病患者miR-124相關CYP11B2基因rs531564位點GC、CC基因型及C等位基因分布頻率均低于單純高血壓患者，GG基因型及G等位基因分布頻率均高于單純高血壓患者，推測該位點C等位基因表達降低、G等位基因表達升高可能促進高血壓并發糖尿病的發生，C等位基因可能是高血壓并發糖尿病的保護基因，G等位基因可能是高血壓并發糖尿病的促發或危險基因。上述結果與對羅馬人群2型糖尿病易感性基因研究的相關結果[18]基本一致。但是，高血壓并發糖尿病究竟是C等位基因降低還是G等位基因增加，抑或是二者共同造成的結果，還需進一步研究。此外，本研究結果顯示，高血壓并發糖尿病患者與單純高血壓患者miR-20相關INSR基因rs1366600位點T、C基因型及等位基因頻率分布未見差異，推測該位點可能對高血壓并發糖尿病的發生無明顯影響。

綜上所述，RAAS相關miR-124 CYP11B2基因rs531564位點多態性可能參與了高血壓并發糖尿病的發生，miR-20 INSR基因rs1366600位點多態性可能與高血壓并發糖尿病的發生無關。

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