Thoc1真核表達(dá)載體構(gòu)建及其與ClC-3蛋白在人宮頸癌細(xì)胞HeLa中的共定位觀察

劉學(xué)強(qiáng)，鄭兆廣，王汝上，鐘杰，何桂芳，徐彬(廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣州50006；廣州康臣藥業(yè)有限公司腎病藥物研究中心)

人類Thoc1蛋白是酵母轉(zhuǎn)錄蛋白1的一種功能性同源物[1]，能夠結(jié)合視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因1的氨基末端結(jié)構(gòu)域。Thoc1可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸，與RNA聚合酶Ⅱ及RNA轉(zhuǎn)錄因子緊密聯(lián)系[2]。癌細(xì)胞需要比正常細(xì)胞更高的Thoc1水平以維持生理活動(dòng)[3]，腫瘤組織中Thoc1表達(dá)水平也顯著高于正常組織[4]。氯離子通道3(ClC-3)是正常細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖必不可少的，在細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等方面均發(fā)揮重要作用[5]。ClC-3可調(diào)控細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，其表達(dá)水平及在細(xì)胞中的分布均呈細(xì)胞周期依賴性，但其是否參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程目前鮮見(jiàn)報(bào)道。2017年1～10月，本研究克隆人Thoc1基因并構(gòu)建pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染和免疫熒光技術(shù)觀察Thoc1和ClC-3在人宮頸癌細(xì)胞HeLa中的表達(dá)及共定位情況，探討ClC-3是否參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌DH5α、人宮頸癌細(xì)胞HeLa和乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室保存；pDsRed2-N1載體為Clontech公司產(chǎn)品。限制性內(nèi)切酶SacⅠ、BamHⅠ、T4 DNA 聚合酶均購(gòu)自NEB(北京)公司；LA Taq酶購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；總RNA提取試劑TRIzol和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美津生物科技有限公司；Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；小鼠抗人ClC-3單抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、0.01 mg/mL牛胰島素、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。兩種細(xì)胞均置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.3 Thoc1基因克隆 ①Thoc1引物設(shè)計(jì)和合成。在GenBank檢索人Thoc1基因核苷酸序列，基因登錄號(hào)NM_005131.2，設(shè)計(jì)Thoc1引物并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。上游引物：5′-GCGCGAGCTCATGTCTCCGACGCCGCCGCT-3′，下游引物：5′-GCGCGGATCCATACTATTTGTCTCATTGTCAT-3′， 上、下游引物分別含SacⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，產(chǎn)物2 092 bp。②Thoc1基因擴(kuò)增。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，按TRIzol試劑和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用Thoc1引物和LA Taq酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系50 μL：模板cDNA 0.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL， LA Taq(5 U/μL) 0.5 μL，2×GC BufferⅠ25 μL，dNTP Mix 8 μL，ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，完成30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后在0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察并鑒定擴(kuò)增的DNA片段，進(jìn)行切膠回收。結(jié)果顯示得到的產(chǎn)物只有1條亮帶，位于約2 000 bp的位置，其分子量大小與理論預(yù)期大小2 092 bp相符。見(jiàn)圖1。

注：M為1 kb DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為Thoc1基因的PCR產(chǎn)物

圖1Thoc1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

1.4 pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pDsRed2-N1，回收Thoc1和pDsRed2-N1線性化載體片段。加入T4 DNA連接酶，于16 ℃條件下連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，37 ℃條件下培養(yǎng)16 h，隨機(jī)取其中4個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。將需經(jīng)PCR鑒定的單克隆菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，內(nèi)切酶SacⅠ和BamHⅠ雙酶切后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。酶切鑒定正確的菌落送華大基因進(jìn)行測(cè)序鑒定，獲得pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體。

1.5 HeLa細(xì)胞Thoc1基因表達(dá)檢測(cè) 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，按1 mL/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)染組及空白對(duì)照組，三組分別采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pThoc1-DsRed2-N1質(zhì)粒、pDsRed2-N1質(zhì)粒及脂質(zhì)體。轉(zhuǎn)染48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)情況并進(jìn)行拍照。

1.6 HeLa細(xì)胞Thoc1和ClC-3共定位觀察 采用免疫熒光技術(shù)。轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染24 h，收集細(xì)胞，按1.5×104/孔接種于預(yù)先置有圓形蓋玻片的48孔板中，培養(yǎng)24 h。PBS洗掉未貼壁的細(xì)胞，免疫染色固定液于室溫固定15 min，封閉液封閉1 h；加入兔抗人ClC-3多克隆抗體，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫避光反應(yīng)1 h；細(xì)胞核染色液DAPI室溫避光染色5 min，滴加抗熒光淬滅封片液，指甲油封固，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。綠色熒光表示ClC-3陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核，紅色熒光表示Thoc1陽(yáng)性表達(dá)。將綠色熒光和紅色熒光進(jìn)行疊加，如果兩者存在共定位，則紅色和綠色重合在一起，顯示為黃色。

2 結(jié)果

2.1 pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果 4個(gè)單克隆菌落PCR鑒定結(jié)果均顯示在約2.1 kb處有一亮帶，提示均為陽(yáng)性克隆菌落(圖2A)。pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體經(jīng)SacⅠ和BamHⅠ雙酶切得到約4.7 kb和2.1 kb的兩個(gè)片段(圖2B)，符合預(yù)期大小，證實(shí)Thoc1 cDNA成功插入到pDsRed2-N1真核表達(dá)載體中。基因測(cè)序結(jié)果顯示，陽(yáng)性克隆與Genebank中Thoc1基因序列完全一致(圖2C)，證實(shí)成功構(gòu)建pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體。

2.2 HeLa細(xì)胞Thoc1基因表達(dá)結(jié)果 空轉(zhuǎn)染組可觀察到較強(qiáng)的紅色熒光，空白對(duì)照組沒(méi)有觀察到紅色熒光，轉(zhuǎn)染組紅色熒光強(qiáng)度介于空轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組之間；證實(shí)HeLa細(xì)胞中存在Thoc1表達(dá)。

2.3 HeLa細(xì)胞Thoc1和ClC-3共定位觀察結(jié)果 ClC-3分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，主要是細(xì)胞核中；Thoc1只分布于細(xì)胞核中。兩者疊加后在細(xì)胞核呈黃色熒光，證實(shí)ClC-3和Thoc1在HeLa細(xì)胞核上存在共同定位。

3 討論

Thoc1是轉(zhuǎn)錄輸出復(fù)合物的重要組成部分，在正常組織中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄延伸[2]和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[6]，在胚胎早期發(fā)育過(guò)程中扮演重要角色[7]。癌細(xì)胞獨(dú)特的基因表達(dá)需要Thoc1核糖核酸蛋白支持，癌細(xì)胞的侵略性表型和不良預(yù)后普遍與Thoc1高表達(dá)相關(guān)[8]。因此，Thoc1有可能成為治療癌癥的一個(gè)潛在分子靶點(diǎn)。但也有部分肺癌細(xì)胞(SPC-A1和NCI-H1975)微量表達(dá)Thoc1，這些肺癌細(xì)胞經(jīng)過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染提高Thoc1表達(dá)后可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，從而抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[9]。因此，Thoc1在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞以及不同組織來(lái)源癌細(xì)胞中的表達(dá)、功能均可能存在明顯差異。

A為單克隆菌落PCR鑒定結(jié)果。M表示1 kb DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1～4表示1～4號(hào)單克隆菌落。B為雙酶切鑒定結(jié)果。M表示1 kb DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1表示SacⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定結(jié)果(兩個(gè)片段約4.7、2.1 kb)。C為陽(yáng)性克隆的測(cè)序鑒定結(jié)果(因序列過(guò)長(zhǎng)，此處僅顯示從起始密碼的部分結(jié)果)。

圖2pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體的鑒定結(jié)果

ClC-3是電壓門控氯離子通道的一個(gè)亞型，參與多種重要的細(xì)胞生理過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和遷移[10]，與癌癥病灶的惡化擴(kuò)大、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。ClC-3在多種腫瘤組織中高表達(dá)。Hermoso等[11]發(fā)現(xiàn)，ClC-3在宮頸癌的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。ClC-3可增強(qiáng)癌細(xì)胞的耐藥性[5]，促進(jìn)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的細(xì)胞膜皺褶形成，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]。因此，ClC-3可能是與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)的關(guān)鍵分子之一。ClC-3參與多種細(xì)胞生理活動(dòng)，但其是否參與了細(xì)胞轉(zhuǎn)錄目前尚未明確。

pDsRed2-N1載體是以紅色熒光蛋白為報(bào)告基因的一種真核表達(dá)載體[13]。本課題組將攜帶起始密碼而不帶終止密碼的Thoc1編碼序列克隆到pDsRed2-N1的多克隆位點(diǎn)中，Thoc1 cDNA 序列與 RFP編碼序列形成融合基因，經(jīng)測(cè)序證實(shí)無(wú)讀碼框移位，因此這種N端融合的蛋白可以不改變天然RFP 的熒光性質(zhì)[14]，指示Thoc1蛋白表達(dá)和定位[15]。本研究構(gòu)建pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體，并通過(guò)PCR、SacⅠ和BamHⅠ雙酶切、基因測(cè)序鑒定證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，空轉(zhuǎn)染組可觀察到較強(qiáng)的紅色熒光，空白對(duì)照組沒(méi)有觀察到紅色熒光，而轉(zhuǎn)染組紅色熒光強(qiáng)度介于空轉(zhuǎn)染組與空白對(duì)照組之間；紅色熒光蛋白基因位于Thoc1基因下游，與Thoc1基因共用一個(gè)啟動(dòng)子，因此本研究結(jié)果證實(shí)Thoc1在HeLa細(xì)胞中有表達(dá)。本研究采用免疫熒光技術(shù)觀察到細(xì)胞核中存在Thoc1與ClC-3蛋白共定位，提示二者在細(xì)胞核中可能存在相互聯(lián)系。ClC-3是與Thoc1直接結(jié)合還是通過(guò)其他蛋白分子進(jìn)行間接連接，仍需要進(jìn)一步研究。由于Thoc1在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中發(fā)揮重要作用，提示ClC-3也有可能參與了細(xì)胞核中的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，或具備參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、RNA加工的功能。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了pThoc1-DsRed2-N1真核表達(dá)載體；Thoc1與ClC-3共定位于HeLa細(xì)胞核，提示ClC-3可能參與細(xì)胞轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

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