雙線竹芋無性繁殖體系建立的研究

□丁云峰馬艷麗 湯松梅鮑勃聿

(1.吉林建筑大學(xué) 吉林 長(zhǎng)春 130118；2.長(zhǎng)春大學(xué) 吉林 長(zhǎng)春 130022)

雙線竹芋（學(xué)名：Calathea sanderiana Gentil），竹芋科肖竹芋屬多年生常綠彩葉草本觀葉植物。雙線竹芋因葉上具有美麗花紋和鮮艷的色彩而深受喜愛，在北方適宜室內(nèi)盆栽觀賞，在南方可露地栽培做為花壇花卉和地被植物。但雙線竹芋無種實(shí)形成，繁殖后代主要依賴分根繁殖，繁殖系數(shù)低、周期長(zhǎng)，既不能滿足生產(chǎn)需求，也無法進(jìn)行品種改良和優(yōu)良品種培育。本項(xiàng)目利用植物生物技術(shù)，通過竹芋快繁無性系的建立和竹芋體細(xì)胞胚性愈傷組織誘導(dǎo)研究，建立了竹芋高頻再生體系，有效改善了竹芋繁殖系數(shù)低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)。該研究既可提高企業(yè)竹芋種苗生產(chǎn)效率和效益，而且建立的快速繁殖體系也為竹芋抗性品種培育、基因工程育種奠定基礎(chǔ)[1、2]。

1 試驗(yàn)材料

培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基、6BA、NAA

愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：①M(fèi)S+6-BA0.5mg/L；②MS+6-BA0.5mg/L+0.2NAA； ③ MS+6-BA1mg/L；④MS+6-BA1mg/L+NAA0.2mg/L；⑤ MS+6-BA2mg/L+NAA0.2mg/L；⑥MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.2mg/L

繼代培養(yǎng)基：A、MS+6-BA0.2mg/L+0.1NAA；B、MS+6-BA0.3mg/L+0.1NAA；C、MS+6-BA0.35mg/L+0.1NAA；D、MS+6-BA0.2mg/L+NAA0.5mg/L；E、MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.5mg/L；F、MS+6-BA0.35mg/L+NAA 0.5mg/L

生根培養(yǎng)基：A、1/2MS+0.1NAA；B、1/2MS+0.5NAA；實(shí)驗(yàn)儀器：高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、培養(yǎng)箱

2 試驗(yàn)方法

組培實(shí)驗(yàn)操作流程：配置MS培養(yǎng)基——外植體消毒——接種——培養(yǎng)

2.1 培養(yǎng)步驟

第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。洗時(shí)加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。

第二步是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。要在超凈臺(tái)或無菌室內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸10～30s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)[3、4]。

第三步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3～5次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用注意：①酒精滲透性強(qiáng)，幼嫩材料易在酒精中失綠，所以浸泡時(shí)間要短，防止酒精殺死植物細(xì)胞。②老熟材料在酒精中浸泡時(shí)間長(zhǎng)一些。③升汞的滲透力弱，一般浸泡10min左右，對(duì)植物材料的殺傷力不大[5]。

2.2 接種前的準(zhǔn)備

配置培養(yǎng)基，按照MS培養(yǎng)基的配置要求配置，其中生長(zhǎng)激素先不放，當(dāng)瓊脂和蔗糖熬好后，根據(jù)之前設(shè)計(jì)的生長(zhǎng)激素的濃度分別注入相應(yīng)劑量的激素，倒入試管中（每只試管20～25ml），貼上標(biāo)簽。經(jīng)高壓滅菌鍋消毒后放在操作臺(tái)上一周左右。

2.3 接種

將裝有培養(yǎng)基的試管放在酒精燈上，迅速將切好的小塊接種于培養(yǎng)基上，立即封口。全部接好后，將其放倒培養(yǎng)箱中觀察。

2.4 接種后的管理

首次培養(yǎng)愈傷組織時(shí)，恒溫箱的門應(yīng)該關(guān)閉不必見光，因?yàn)樵跓o光條件下，愈傷組織長(zhǎng)得更快。定期去觀察，一發(fā)現(xiàn)有感染的試管苗，立即拿走，以免感染其他試管苗。另外，還要照相記錄。兩周之內(nèi)可以看到外植體上長(zhǎng)逐漸長(zhǎng)出乳白色或黃白色的廇狀愈傷組織。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果與分析

由表1、2可以看出，3組愈傷組織誘導(dǎo)數(shù)為8個(gè)，是所有組中最多的一組，但是愈傷組織的形態(tài)并不是最好的一組，與之相比，4組、5組的愈傷組織形態(tài)是比較好的。4組外植體的原莖0.7cm、愈傷組織1.8cm、高為0.7cm；5組原莖0.7cm、愈傷組織1.8cm、高0.7cm。4、5組的培養(yǎng)基中都沒有加入NAA，這兩組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NAA并不能促進(jìn)愈傷組織的誘導(dǎo)，反而會(huì)有抑制的作用。6組中外植體愈傷組織誘導(dǎo)最好的原莖0.8cm、愈傷組織1.8cm、高1cm，也是實(shí)驗(yàn)中外植體愈傷組織最大誘導(dǎo)體。而1組中外植體的愈傷組織相對(duì)差一點(diǎn)。葉芽誘導(dǎo)苗向下生長(zhǎng)的比向上生長(zhǎng)的粗壯，由于向下生長(zhǎng)，幼苗直接進(jìn)入培養(yǎng)基中，養(yǎng)分供應(yīng)充足，因此生長(zhǎng)比較粗壯。

表1 莖的愈傷組織誘導(dǎo)的形態(tài)

表2 成活率和誘導(dǎo)率

3.2 雙線竹芋繼代培養(yǎng)結(jié)果與分析

將初代培養(yǎng)所形成的愈傷組織以及芽接種到繼代培養(yǎng)基上，進(jìn)行增殖培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)基A（6-BA 2.0mg/L，NAA0.1mg/L） 和 B（6-BA3.0mg/L，NAA0.1 mg/L）比較適合雙線竹芋愈傷組織的繼代培養(yǎng)，繼代率分別為2.5倍和3.2倍。

3.3 雙線竹芋生根培養(yǎng)結(jié)果與分析

將繼代培養(yǎng)所形成的嫩芽接種到生根培養(yǎng)基上，放在恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，直到發(fā)育成一株完整的植株。培養(yǎng)基 H（1/2MS+6-BA0mg/L+NAA0.5mg/L）適合雙線竹芋的生根培養(yǎng)，生根率達(dá)到93%。

4 試驗(yàn)結(jié)論

（1）雙線竹芋的組織培養(yǎng)可以用于新品種的繁殖，優(yōu)良品種的脫毒和復(fù)壯。

（2）NAA：0mg/ml、6-BA：1.0 mg/ml，這個(gè)激素的濃度并適合雙線竹芋葉芽誘導(dǎo)。

（3）6-BA2.0mg/L，NAA0.1mg/L；6-BA3.0mg/L，NAA 0.1mg/L這個(gè)激素的濃度并適合雙線竹芋愈傷組織的繼代培養(yǎng)。

（4）NAA對(duì)雙線竹芋愈傷組織的誘導(dǎo)有抑制作用。

[1]張士卓.豹紋竹芋微體快繁技術(shù)研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[2]唐玲.青蘋果竹芋組培快繁體系建立的探討[J].中國(guó)科技信息,2014(12)：49-50.

[3]夏時(shí)云,付任勝,張德嵐,馬武赟.不同消毒處理對(duì)竹芋組培無菌外植體獲得的影響[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,15(02)：6-8.

[4]關(guān)麗霞,韓德偉,王振龍,楊智.青蘋果竹芋的組培快繁技術(shù)[J].北方園藝,2007(06)：223-226.

[5]鄭曉薇.幾種肖竹芋屬植物的組織培養(yǎng)[D].北京林業(yè)大學(xué),2007.