腹瀉幼犬糞便中沙門氏菌的分離與鑒定

凌清標 福建省莆田市秀嶼區笏石畜牧獸醫站 福建莆田 351146

沙門氏菌（Salmonella）屬于革蘭氏陰性桿菌，是一種重要的人獸共患致病菌，其主要在人和動物的腸道內寄生。自1885年首次從患畜體內分離到豬霍亂沙門氏菌至今，全世界范圍內沙門氏菌血清型已經達到2 500多種，部分血清型可以引起嚴重的沙門氏菌病，甚至造成死亡[1]。全世界人沙門氏菌感染有逐漸上升的趨勢，由沙門氏菌引起的細菌性疾病也在增加，對畜牧業發展、人類健康造成嚴重危害，因此，控制沙門氏菌的傳播對于食品安全和獸醫公共衛生有著重要的意義。隨著人民生活水平的提高，寵物飼養越來越多，其作為人獸共患病的傳染源給寵物飼養者和社會公共健康造成嚴重的威脅。該研究從一例診斷為細菌性腹瀉幼犬病例的糞便中進行細菌分離，得到一株疑似沙門氏菌，并且進行分子生物學鑒定和藥敏試驗。

1 材料和方法

1.1 樣品采集 用棉拭子無菌采集腹瀉幼犬的直腸拭子。

1.2 主要試劑 TSA、HE瓊脂、BS瓊脂、革蘭氏染色液均購自青島海博生物科技有限公司；2×PCR Mixture、DL2000 DNA Marker購自TAKARA公司。

1.3 細菌分離 采集的拭子直接涂抹TSA平板、HE瓊脂平板、BS瓊脂平板，置37℃培養16~24 h，無菌挑取10~12個單菌落進行革蘭氏染色，并對染色形態一致的菌落在新鮮的TSA平板劃線純培養。

1.4 沙門氏菌PCR鑒定 細菌DNA的提取[2]：采用熱裂解法提取DNA，挑純培養物單菌落在EP管重懸于100 μL蒸餾水中，煮沸10 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清為DNA模板，置-20℃冰箱保存、備用。

PCR擴增：參照2013年查華等報道的沙門氏菌腸毒素基因stn引物序列[3]，由福州尚亞生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 沙門氏菌基因引物序列

PCR反應體系與反應條件：反應體系見表2。反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火 30 s，72 ℃延伸 30 s，35 個循環；72 ℃延伸5 min。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，在凝膠成像系統下觀察結果。

表2 PCR反應體系

1.5 藥敏試驗 藥敏紙片購自杭州天和微生物有限公司，包括頭孢噻肟、氨芐西林、氯霉素、慶大霉素、四環素、卡那霉素、環丙沙星、氟苯尼考、多西環素，試驗方案按照CLSI標準進行。

2 結 果

2.1 細菌菌落形態 經過37℃培養，在TSA平板上長出形態均一的菌落，在HE平板上長出藍綠色、中心呈現黑色的菌落[1]，而在BS平板上呈現棕褐色、有金屬光澤、周圍培養基呈棕色的菌落[1]（見圖1），挑取單菌落經革蘭氏染色、鏡檢，均為革蘭氏陰性腸桿菌，疑似為沙門氏菌。

圖1 分離菌在HE培養基（左）和BS培養基（右）上生長狀態

2.2 疑似菌PCR鑒定 采用沙門氏菌腸毒素基因stn的特異性引物，對挑取的疑似菌落進行PCR檢測，挑取的單菌落均為陽性（見圖2）。因此，該次從腹瀉幼犬糞便中分離到的病原可確定為沙門氏菌。

圖2 可疑菌的PCR鑒定

2.3 沙門氏菌藥敏試驗 按照CLSI標準進行判定，分離到的沙門氏菌對頭孢噻肟、環丙沙星、氟苯尼考敏感，對氨芐西林中等耐藥，對氯霉素、慶大霉素、四環素、卡那霉素、多西環素耐藥。

3 討 論

本研究從腹瀉幼犬糞便中進行病原分離，經鑒定為沙門氏菌，并對該株沙門氏菌進行了初步的藥敏試驗分析，僅對頭孢噻肟、環丙沙星、氟苯尼考敏感，與當時使用頭孢噻肟治療的效果一致。而分離菌株對多數抗生素具有耐藥性，提示寵物飼養人員需要提高警惕，防止沙門氏菌對家庭成員生活環境和周圍環境造成污染引發公共衛生健康問題。因此，要加強寵物管理，提高寵物飼養人員的衛生健康意識，防止人獸共患病從寵物向人傳播而造成人的感染和發病。

[1]陸承平.獸醫微生物學[M].4版.北京：中國農業出版社,2007.

[2]王軍.亞抑菌濃度抗生素對豬源耐藥沙門氏菌生物膜形成的影響[D].武漢：華中農業大學,2012.

[3]查華,石火英,吉貞穎,等.2010-2012年蘇皖兩省雞白痢沙門氏菌的分離鑒定及耐藥性分析[J].中國家禽,2013,35(4)：17-20.