晚期糖基化終末產物對卵巢原始卵泡的影響

朱楠，黃小圓，李金晶，葛紅山，2*

(1.溫州醫科大學第二臨床醫學院，溫州 325000；2.泰州市人民醫院，泰州 225300)

隨著二胎政策的全面開放，女性生育年齡普遍推遲。研究表明，女性生育能力在經歷21～25歲的生育高峰后，開始逐漸下降，至35歲后發生急劇下降[1]。卵巢作為一種長壽命組織，其衰老的發生早于機體的衰老。卵巢衰老引起的女性不孕及內分泌紊亂等問題已成為影響女性生活質量的重要因素。卵巢衰老主要表現為卵泡數目的減少和卵母細胞質量的下降[2]。作為卵巢中數量最多的卵泡，原始卵泡的激活貫穿于整個生育階段，且直接影響卵泡的數量，是決定卵巢儲備能力的重要因素[3]。原始卵泡處于減數分裂前期的雙線期，它由單層扁平的顆粒細胞包繞初級卵母細胞而形成[3]。1992年，Hirshfield[4]提出將原始卵泡分為“第一波原始卵泡”和“成年原始卵泡”，前者位于卵巢髓質部，形成后立即啟動；后者位于卵巢皮質部，形成后一直保持靜息狀態，成年期開始分批啟動。目前這一觀點被越來越多實驗結果所支持。

卵巢衰老的具體機制目前尚不明確。最近的研究認為，晚期糖基化終末產物(AGEs)與卵巢衰老密切相關[5]。AGEs是對非酶糖基化反應(Mailland反應)終末產物的總稱，在人體的長壽命組織和器官中發生增齡性積累，與蛋白直接交聯引起相關蛋白的變性失活，同時還可與AGEs受體(RAGE)結合形成AGEs-RAGE軸介導細胞氧化應激和羰基應激，是研究衰老的重要指標之一[6]。研究表明，AGEs引起的損傷對配子的形成、胚胎著床、胚胎發育等人類各個生殖階段均產生重要的影響[7]，即AGEs在卵巢中堆積會加速卵巢衰老的發生[8]。本實驗主要研究AGEs是否會通過影響原始卵泡激活從而引起卵巢衰老的發生。

材料與方法

一、材料和動物

1.動物：成年 ICR小鼠購自溫州醫科大學動物實驗中心。以雄雌比例1∶2合籠，次日檢查陰道栓確認妊娠，單籠飼養直至分娩獲得4日齡乳鼠。

2.試劑：AGE-BSA制劑(10 mg/ml)購于美國Merck Millipore公司，培養小室購于美國Millipore公司；DEME/F12(1∶1)培養基、Albumax、青/鏈霉素雙抗購于美國Gibco公司；L-ascorbic acid、ITS購于日本Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、HE染料試劑盒、BCA試劑盒購于碧云天生物技術有限公司；兔抗RAGE多克隆抗體購于美國Abcam公司、羊抗細胞增殖核抗原(PCNA)多克隆抗體購于美國Santa cruz公司，兔抗β-actin多克隆抗體購于美國Bioworld公司，HRP標記的山羊抗兔、兔抗山羊二抗購自美國Biosharp公司；DAB顯色試劑盒、兔二步法檢測試劑盒、山羊超敏檢測試劑盒購自中杉金橋。

二、方法

1.卵巢培養：將實驗組分為空白對照組、溶劑對照組、AGE-BSA組。其中，空白對照組以DEME/F12(1∶1)為基礎培養液，其內加入1‰ BSA、1‰ Albumax、0.05 mg/ml L-ascorbic acid、1%ITS和1‰青/鏈霉素雙抗；溶劑對照組使用的培養液是在空白對照組培養液的基礎上添加200 μg/ml BSA；AGE-BSA組培養液則是在空白對照組培養液的基礎上將購買的10 mg/ml AGE-BSA配制成200 μg/ml AGE-BSA終濃度。取200只4日齡雌性乳鼠為實驗對象，解剖顯微鏡下完整剝離乳鼠卵巢，將其隨機轉移至各組培養小室內(3顆/室)，置于5%CO2、37℃培養箱內培養，隔日換半液，4 d后收集各組卵巢。

2.HE染色：各組收集的卵巢用4%多聚甲醛固定過夜(12～24 h)，經脫水、透明、浸蠟、包埋后，選取最大橫截面進行切片。將切片置于65℃烤箱內烘烤1 h，二甲苯脫蠟、梯度酒精(100%、95%、75%、蒸餾水)中各5 min，滴加蘇木素染料浸染5 min，自來水下返藍15 min，伊紅染料浸染2 min，然后經梯度酒精脫水(95%Ⅰ、95%Ⅱ、100%)、二甲苯透明各5 min后封片；鏡下計數各級卵泡數量，分析比較各組中原始卵泡和生長卵泡[9](包括初級卵泡和次級卵泡)構成比。本實驗中不計數成熟卵泡和閉鎖卵泡。

3.免疫蛋白印跡(Western Blot)：收集各組培養4 d后的卵巢組織，每組每批使用30個卵巢，重復3次，分組分批提取總蛋白，BCA試劑盒測量各組蛋白濃度；將抽提蛋白按每孔25 μl在12% SDS-PAGE電泳，然后將分離的目的蛋白電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉-TBST搖床上室溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次5 min，分別加入對應的一抗[RAGE抗體(1∶1 000)、PCNA抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶2 500)]4℃搖床孵育過夜；次日，PVDF膜用TBST洗滌3次，每次5 min，分別與HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5 000)、兔抗山羊IgG(1∶5 000)二抗進行室溫搖床孵育2 h，TBST洗滌3次，每次5 min。目的蛋白條帶應用化學發光法進行檢測，將每次實驗中的RAGE和PCNA的灰度值與內參β-actin比較，使用Image Lab 3.0 軟件進行半定量分析。

4.免疫組織化學：組織切片烤片、脫蠟、水化同前，將組織切片放入500 ml枸櫞酸鈉緩沖液中進行高壓修復10 min；室溫下自然冷卻，PBS洗滌3次，每次5 min，3%H2O2室溫下濕盒孵育切片組織10 min，PBS洗滌3次，每次5 min，封閉液(10%山羊血清)室溫濕盒孵育20 min，甩去封閉液，滴加PCNA抗體(1∶50)4℃濕盒孵育過夜，同時設立陰性對照組即使用PBS進行孵育；次日37℃水浴箱復溫30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，使用兔二抗、山羊二抗室溫孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min；DAB顯色液逐一鏡下顯色，待組織出現棕黃色后，甩去顯色液，蘇木素復染1 min，梯度酒精(75%、85%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ)脫水、二甲苯透明各5 min，封片后鏡下觀察切片顯色情況。

三、統計學方法

結 果

一、AGE促進原始卵泡向生長卵泡轉化

為了觀察AGE對原始卵泡激活的影響，本實驗取每組各10張培養后的卵巢切片，分別代表每組10個不同的卵巢，通過HE染色，分別計數各組原始卵泡和生長卵泡及其占總卵泡數的比例。我們發現在空白對照組和溶劑對照組培養的卵巢在原始卵泡構成比和生長卵泡構成比中均無顯著差異(F=2.898，P0.05)(表1)，說明較基礎培養液而言，BSA不影響卵巢卵泡的發育。而在AGE-BSA組中，生長卵泡構成比顯著高于溶劑對照組，而原始卵泡構成比則顯著低于溶劑對照組(F=2.776，P<0.001)(表1)。觀察HE染色圖我們發現，在AGE-BSA組卵巢最大橫截面切片中，卵巢髓質部出現大量形態表現為原始卵泡的卵泡(圖1)。

表1 各實驗組的卵泡計數及卵泡構成比(-±s)

注：每組10個卵巢；與其他兩組比較，*P<0.001

A：空白對照組；B：溶劑對照組；C：AGE-BSA組。圖中黑色箭頭示原始卵泡，紅色箭頭示初級卵泡，綠色箭頭示次級卵泡。標尺為50 μm圖1 不同處理組中卵巢卵泡的形態表現(HE染色，×200)

二、AGE促進PCNA表達

為了進一步明確原始卵泡的生長情況，我們檢測了卵泡增殖相關指標PCNA的蛋白表達情況，結果發現PCNA在AGE處理組中的表達量顯著增加(F=6.72，P<0.05)(圖2，圖3A)。同時PCNA在空白對照組和溶劑對照組中表達無顯著差異(F=4.54，P0.05)(圖2，圖3A)。免疫組織化學實驗發現PCNA表達在各級卵泡的顆粒細胞和卵母細胞中(圖4)。

圖2 Western Blot檢測各實驗組中RAGE、PCNA的蛋白表達

三、AGE促進受體RAGE的表達

為了進一步驗證AGE對原始卵泡生長的作用，我們用免疫蛋白印跡法半定量檢測各實驗組內AGE受體RAGE的表達。結果發現，與溶劑對照組相比，RAGE在藥物處理(AGE-BSA)組中的表達顯著增加(F=3.24，P<0.001)，說明AGE可能是通過AGE-RAGE軸引起卵巢內卵泡的變化；RAGE在空白對照組和溶劑對照組中表達無顯著差異(F=3.23，P0.05)(圖2，圖3B)。

A：PCNA蛋白相對含量；B：RAGE蛋白相對含量；與溶劑對照組比較，*P<0.05，#P<0.001圖3 各實驗組PCNA、RAGE蛋白的相對含量

左側為3組的低倍視野圖像(×200)，右側為左側方框區域的高倍視野(×400)；圖中黑色箭頭所指的棕黃色部分為PCNA陽性表達部位。標尺為50 μm圖4 PCNA在各實驗組中的定位表達(免疫組織化學SP染色)

討 論

近年來，由于生育年齡的普遍推遲以及一些醫源性因素(如手術機械性損傷、腫瘤術后放化療)導致的卵巢衰老所引起的女性不孕等問題被大家廣泛關注。在卵巢衰老過程中，原始卵泡作為卵巢內數量最多的卵泡，其過早激活將直接導致卵泡池的提前耗竭，從而引起卵巢衰老的發生。另外，相關研究表明隨著AGEs在卵巢內的增齡性積累，AGEs與原始卵泡的激活具有相關性。多項研究發現AGEs可以通過干擾卵巢顆粒細胞內PI3K/Akt信號通路，導致多囊卵巢綜合征(PCOS)患者胰島素抵抗和無排卵的發生[10-11]。而在化療藥物對卵巢衰老作用機制的研究中發現順鉑能通過激活PTEN/Akt/FOXO3信號通路，增加生長卵泡池，促進卵巢衰老的發生[12]。另外，大量研究表明，細胞內AGEs-RAGE信號通路是AGEs介導產生一系列病理反應的主要機制[13-14]。由此推測，AGE在與其受體RAGE結合后，可能通過以Akt分子為中心的信號通路激活原始卵泡，加速卵巢衰老發生。

為了驗證上述猜想，本實驗通過體外添加AGE-BSA制劑培養卵巢。研究發現小鼠卵巢內原始卵泡的形成開始于出生前2 d左右，持續至出生后3～4 d[15]。由此，我們選取4日齡小鼠為研究對象。基于本課題組前期研究已經證明200 μg/ml AGE-BSA能明顯促進休眠期原始卵泡的激活，我們有了以下發現：經AGE-BSA處理后，生長卵泡占總卵泡數的比例顯著增加，同時伴隨著卵巢髓質部原始卵泡的出現。結合Hirshfield[4]提出的原始細胞二分類理論，我們猜測AGEs可能在激活皮質部原始卵泡生長的同時激活了卵巢髓質部的原始卵泡，以此耗竭卵泡池。為了進一步驗證以上實驗結果，我們選取了卵泡計數更為靈敏的指標——細胞增殖核抗原(PCNA)。PCNA被發現存在于多種哺乳動物的卵巢內。研究表明大鼠卵巢PCNA的表達與顆粒細胞、卵母細胞生長同步，因此，PCNA陽性表達可作為卵泡生長的標志[16]。Picut等[17]發現PCNA表達在卵巢各級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞內，本實驗結果與之一致。免疫印跡法結果表明PCNA在AGE組中高表達，這與卵泡計數中總卵泡數增加的結果一致。另外，有研究發現PCNA開始表達于DNA合成的G1晚期，S期達高峰，之后逐漸下降[18]。由此我們猜測AGEs可以使卵泡中卵母細胞和顆粒細胞處于增殖狀態，從而導致其蛋白高表達。

AGEs受體有很多，RAGE作為其高親和性受體，主要分布于外周血單核-巨噬細胞系統、血管內皮等，在正常女性卵巢顆粒細胞、卵泡內膜細胞、內皮細胞、基質細胞亦有表達[19]。研究表明，隨著年齡的增大，顆粒細胞RAGE的表達也隨之上升[20]。本實驗中，AGE處理后RAGE的蛋白表達顯著增加，進一步支持了AGE促進原始卵泡激活的實驗結果。

綜上，我們認為一定濃度的AGEs可能是通過促進卵巢髓質部原始卵泡的激活，耗竭卵泡池，最終引起卵巢衰老的發生。接下來，我們將進一步研究AGEs促進原始卵泡激活的分子作用機制，通過緩解原始卵泡池的消耗速度，盡可能地減緩女性由于年齡增加引起的卵巢儲備功能下降的發生，為治療由卵巢衰老引起的女性不孕等疾病提供新的思路。

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