胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達及其與臨床特征的關系

周海萍 沈忠磊

胰腺癌是臨床上高發的惡性消化道腫瘤之一。近年來隨著飲食結構的改變，胰腺癌發病率呈逐年上升趨勢，嚴重影響著人們的健康[1-3]。有學者對胰腺癌分子發病機制進行研究，發現在正常情況下，Hedgehog（HH）信號通路是哺乳動物胚胎發育、器官形成和干細胞維持的重要基礎，但其非正常激活可能與多種癌癥的發生密切相關，腦膠質瘤相關癌基因-1（Gli1）被認為是HH信號通路活化的指標，且在多種腫瘤組織中表達升高[4-6]。胰腺癌具有嗜神經的特點，Sema4D是一種免疫信號素，參與神經的生長發育過程，同時在免疫和血液系統中發揮作用；從蛋白B1（Plexin-B1）作為其受體，兩者結合可參與細胞侵襲、生長以及遷徙，與胰腺癌的發生、發展有著密切聯系[7-9]。因此，本文就胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達及其與臨床特征的關系作一探討，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集本院2013年1月至2016年5月經手術后病理學證實的胰腺癌組織標本69份，69例胰腺癌患者中男 36 例，女 33 例；年齡 41～77（58.3±12.6）歲；臨床分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期29例，Ⅲ期29例；組織分化程度：高分化19例，中分化24例，低分化26例；伴有淋巴結轉移37例。為進行對照研究，又在2016年5至12月手術切除的34例胰腺癌組織標本中切取了距胰腺癌組織3cm以外的正常胰腺組織標本34份。納入標準：（1）患者術前未接受放化療、免疫治療；（2）各項資料完整。排除合并其他部位腫瘤、既往有放化療史的患者。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化染色 將標本組織作厚4μm的連續切片，石蠟包埋，常規脫蠟至水，切片浸入50mmol/L乙二胺四乙酸溶液（pH 8.0）中。用微波抗原修復10min，冷卻至室溫，充分水洗，PBS浸洗。滴加正常山羊血清封閉液，室溫維持20min。去掉多余液體，加入Plexin-B1、Gli1多抗或單抗，維持4℃過夜，PBS浸洗。加入SP 9 000通用型生物素標記二抗，37℃維持40min；用二氨基聯苯胺（DAB）顯色30s，再用蘇木素復染，最后用系列乙醇脫水及透明，用中性樹膠封固，在光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 結果判斷標準 Plexin-B1蛋白主要表達于細胞核和細胞質，Gli1蛋白主要表達于細胞質和細胞膜，均呈黃色、棕黃色、褐色表達。（1）著色強度：無色為0分，淡黃色為色1分，棕黃色為2分，褐色為3分；（2）陽性細胞所占比例：≤10%為1分，＞10%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分；以上2種得分相乘所得總分＜3分為陰性，≥3分為陽性；＜3分為“-”；3～5分為“+”，6～9 分為“++”，＞9 分為“+++”。

1.3 統計學處理 應用SPSS 16.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達的相關性分析采用Spearman秩相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種組織標本中Plexin-B1、Gli1蛋白表達比較胰腺癌組織Plexin-B1、Gli1蛋白表達陽性率分別為72.46%（50/69）、53.62%（37/69），均高于正常胰腺組織的 20.59%（7/34）、26.47%（9/34），差異均有統計學意義（χ2=24.80、6.79，均P＜0.05），見表1。

表1 兩種組織標本中Gli1蛋白表達水平比較（例）

2.2 69例胰腺癌患者Plexin-B1、Gli1蛋白表達與臨床特征的關系 不同臨床分期、腫瘤直徑、是否淋巴結轉移的患者胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；不同年齡、腫瘤部位、組織分化程度的患者胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 69例胰腺癌患者Plexin-B1、Gli1蛋白表達與臨床特征的關系[例（%）]

2.3 胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達的相關性 胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達呈正相關（rs=0.885，P＜0.05），見表3。

表3 69份胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達的相關性（例）

3 討論

胰腺癌初期癥狀往往不明顯，早期診斷較為困難。等到患者就診時，往往已發生了轉移或侵犯了重要血管，故而無法采用根治性手術進行治療。在諸多治療方法中，手術切除是效果較好的方法。但因胰腺癌的神經和淋巴轉移特性，易造成術后短期腫瘤復發、預后較差。因此，早發現、早治療是治愈胰腺癌的關鍵[10-11]。胰腺癌具有嗜神經性，神經浸潤會導致疼痛；此外，還會導致癌細胞轉移。神經周圍浸潤（PNI）是胰腺癌的一種復發方式，主要指腫瘤細胞局部浸潤進入神經周圍的間隙或穿破神經外膜沿著神經束膜浸潤的一種現象。Sema4D是一種免疫信號素，屬于軸突生長導向因子中的跨膜分子的Semaphorin家族的一員，參與神經的生長發育過程，同時也在免疫系統和血液系統中發揮著作用。Sema4D高親和作用受體為Plexin-B1，兩者的結合可磷酸化Met下游的某些信號分子，從而參與細胞侵襲、生長以及遷徙，與胰腺癌的發生、發展有著密切關系。有文獻報道Plexin-B1蛋白在胰腺癌組織中高表達[12-13]。HH信號通路正常激活，是哺乳動物胚胎發育、器官形成和干細胞維持的重要基礎，而非正常激活可能與多種癌癥的發生密切相關?；蚨ㄎ挥谌祟?2號染色體的Gli1蛋白是HH信號通路的終末，也是其重要的轉錄激活因子，Gli1蛋白表達升高會激活目的基因的轉錄。通過調控HH信號通路目的基因的轉錄，以調節腫瘤細胞增殖、分化及轉移等多種分子的基因轉錄水平，進而影響腫瘤的發生、發展，被認為是HH信號通路活化的指標[14-15]。

本研究比較胰腺癌組織與癌旁正常組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達，發現胰腺癌組織中兩種蛋白表達陽性率均明顯高于癌旁正常組織；間接說明胰腺癌的發生與Plexin-B1、Gli1蛋白表達密切相關。為深入研究Plexin-B1、Gli1蛋白表達與胰腺癌發生、發展的關系，本文探討了兩者與胰腺癌患者臨床特征的關系，結果表明胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達與臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移等有關，進一步說明Plexin-B1、Gli1可能參與了胰腺癌發生、發展的全過程。因此，臨床上可以應用Plexin-B1、Gli1作為早期診斷胰腺癌的腫瘤標識物，且有望成為治療胰腺癌的新分子靶點。由于胰腺癌早期癥狀不明顯，因此早期診斷較為困難，僅采用一種腫瘤標識物的確診率往往較低，故本研究探討了胰腺癌組織中Plexin-B1與Gli1蛋白表達的相關性，發現兩者呈正相關；這表明Plexin-B1、Gli1有望成為早期診斷胰腺癌的聯合腫瘤標識物，以提高臨床確診率。

綜上所述，胰腺癌組織中Plexin-B1、Gli1蛋白表達陽性率明顯升高，與患者的臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移等有關。Plexin-B1、Gli1有望成為早期診斷胰腺癌的腫瘤標識物，且兩者聯合診斷可提高確診率。

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