果蔬酵素對黑色素生成的影響

張瑞雪 ，馬勇 ，劉宇，劉博，谷瑞增 ，魏穎 *

1. 中國食品發酵工業研究院有限公司（北京 100015）；2. 北京市蛋白功能肽工程技術研究中心（北京 100015）；3. 寧夏光彩生物科技有限公司（銀川 750004）

人類膚色與黑素細胞生成的黑色素在皮膚中的含量和分布狀態有關，美白作用主要是防止色素的生成及促使生成的色素排出體外2條途徑。黑色素的合成必需有3種物質：底物酪氨酸、反應關鍵酶——酪氨酸酶及氧元素[1]。酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，廣泛存在于生物體中，是黑色素生成的限速酶，催化L-酪氨酸為L-左旋多巴（L-DOPA），進一步被氧化成L-多巴醌，合成黑色素[2]。隨著現代社會科技和經濟高速發展，生活節奏加快，越來越多的年輕人開始熬夜，導致黑色素沉積，無法正常排出體外，皮膚暗黃無光，最終形成色斑。隨著化妝品行業的發展和成熟，消費者對美白護膚產品要求越來越高，開發安全有效的美白產品顯得尤為重要。酵素在化妝品行業中應用廣泛，有重要的研究價值和意義。

酵素原是日本對于酶的稱呼，后相繼傳入臺灣和大陸，酶是一種具有催化作用的生物活性分子，能降低反應的活化能，從而加快反應速度，是一種狹義上的酵素。目前酵素具有廣泛意義，不僅包括酶，還包括產酶微生物、相關調控因子及代謝產物等，其富含多種維生素、礦物質、低聚糖、多酚、功能性酶類等，具有抗氧化、抑菌消炎、解酒護肝、調節腸道菌群等功能。酵素發酵主要是利用酵母菌、乳酸菌和霉菌對原料水果、蔬菜、糙米、菇類和藥食同源中藥等進行微生物代謝活動，實現糖類、蛋白質、脂質三大物質之間的轉化[3]。人體皮膚中存在多種酵素，以幫助表皮細胞的再生及皮脂腺、汗腺的分泌，能為皮膚細胞帶來活力，加快其新陳代謝[4]。有研究表明酵素產品具有美白抗衰老功能，能抵御紫外線對皮膚的傷害，抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的生成。試驗主要研究比較3種不同果蔬酵素對酪氨酸酶活的抑制作用、黑色素生成量及抗氧化能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果蔬酵素（寧夏光彩生物科技有限公司）；臺灣大漢酵素；日本萬田酵素；小鼠黑色素瘤細胞B16（北京協和細胞資源中心）；左旋多巴（L-DOPA）、DCFH-DA、AAPH；四甲基偶氮唑鹽（MTT，Sigma公司）；高糖DMEM培養基（Hyclone公司）；胎牛血清（FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司）；0.25%胰蛋白酶、緩沖液PBS、曲拉通X-100（碧云天生物技術研究所）；二甲基亞砜（DMSO，西隴化工股份有限公司）；NaOH（分析純，北京化工廠）。

1.2 儀器與設備

BD C 6流式細胞儀；240 i直熱式二氧化碳培養箱（美國Thermofisher公司）；Spectra MR多功能酶標儀（美國Dynex公司）；恒溫水浴鍋（蘇州珀西瓦爾實驗設備有限公司）；ESCO AC 2-6 S 1生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養

用含體積分數1%雙抗和10% FBS的高糖DMEM完全培養基，在37 ℃、5% CO2的二氧化碳培養箱中培養B16細胞，待細胞長滿后，按1︰3進行傳代。

1.3.2 果蔬酵素對B16細胞增殖的影響

選擇對數生長期及生長狀態良好的細胞，用胰酶將其消化，調整細胞密度為105CFU/mL，按100 μ L/孔接入96孔板中。24 h細胞貼壁后，換上含有果蔬酵素樣品的DMEM不完全培養基，將試驗分為空白組和樣品組，培養48 h后，棄掉培養液，PBS清洗，MTT法測定增殖率。增殖率用樣品組的吸光度占空白組的吸光度表示。

1.3.3 果蔬酵素對B16細胞酪氨酸酶活性的影響

參照劉朝圣等[5]的方法進行測定，各組細胞及上樣情況同1.3.2，將細胞分為空白組和樣品組。樣品作用48 h后，棄上清液，PBS清洗，每孔加入100 μL 0.1%的曲拉通X-100溶液，振蕩5 min，細胞完全裂解后加入50 μL 0.1%/孔的L-DOPA溶液，于37 ℃反應30 min后，酶標儀檢測475 nm處的吸光度，結果以酪氨酸酶激活率表示。

1.3.4 果蔬酵素對B16細胞黑色素含量的影響[6]

將細胞密度調整為105CFU/mL，按2 mL/孔接入6孔板中，24 h后換上含樣的不完全培養基，將細胞分為空白組和樣品組，培養48 h。棄上清液，PBS清洗，用胰酶將細胞消化，NaOH裂解法測定胞內黑色素含量，黑色素含量用樣品組的吸光度占空白組的吸光度表示。

1.3.5 果蔬酵素對B16細胞氧化應激的影響

測定細胞內活性氧水平參考尹曼等[1]的方法，用流式細胞儀檢測胞內ROS含量，結果以ROS相對產生率來表示對細胞氧化應激的影響。

1.4 統計學處理

采用Origin 8.5統計軟件對數據進行處理，試驗結果以均值±標準偏差（mean±SD）表示。采用組間t檢驗，p＜0.05具有顯著性差異，p＜0.01具有極顯著性差異。

2 試驗結果

2.1 3種果蔬酵素對細胞增殖的影響

3種果蔬酵素對B16細胞增殖的影響結果見圖1。在9個濃度下，3種果蔬酵素對B16細胞均無顯著毒性，可利用這3種酵素及其濃度進行后續相關試驗操作，評價其美白作用。

圖1 3種果蔬酵素對B16細胞增殖的影響

2.2 3種果蔬酵素對細胞酪氨酸酶活的影響

3種果蔬酵素對B16細胞酪氨酸酶活的影響結果見圖2。3種果蔬酵素在試驗的所有濃度下對B16細胞酪氨酸酶的活性均有抑制作用。在寧夏果蔬酵素中，除稀釋倍數為10和107濃度，其余各濃度對酪氨酸酶活具有極顯著的抑制作用（p＜0.01），且在原液和稀釋倍數為2的濃度下酶激活率最低。在臺灣酵素中，除稀釋倍數為102，103和104濃度，其余各濃度對酪氨酸酶活具有極顯著的抑制作用（p＜0.01），在原液和稀釋倍數為2的濃度下酶激活率最低。在日本酵素中，除稀釋倍數為103和104這2個濃度，其余各濃度對酪氨酸酶的活性具有極顯著的抑制作用（p＜0.01），在稀釋倍數為10和102濃度下酶激活率最低。在原液濃度下，臺灣和日本蔬酵素的酪氨酸酶激活率分別為0.75和0.84，寧夏果蔬酵素為0.55，相較于其他2種酵素，分別降低0.20和0.29。相較于其他2種酵素的酪氨酸酶激活率的最低值，寧夏果蔬酵素酶激活率最低，抑制酶的活性作用更強。

圖2 3種果蔬酵素對B16細胞酪氨酸酶活的影響

2.3 3種果蔬酵素對細胞黑色素含量的影響

3種果蔬酵素對B16細胞黑色素含量的影響結果見圖3。3種酵素對B16細胞的黑色素含量有一定的抑制作用。在寧夏果蔬酵素中，在稀釋倍數為103，104和1053個濃度下，能顯著減少黑色素的產生量（p＜0.05）。在臺灣酵素中，在稀釋倍數10的濃度下能顯著減少黑色素含量（p＜0.05）。在日本酵素中，稀釋倍數為10和1022個濃度下能顯著減少黑色素含量。在稀釋倍數103濃度下，臺灣和日本蔬酵素的黑色素含量分別1.00和0.97，寧夏果蔬酵素為0.90，相較于其他2種酵素，分別降低0.10和0.07。結合3種果蔬酵素對B16細胞酪氨酸酶活的影響結果，寧夏酵素的美白效果更明顯。

圖3 3種果蔬酵素對B16細胞黑色素含量的影響

2.4 3種果蔬酵素對細胞氧化應激的影響

3種果蔬酵素對B16細胞胞內ROS產生量的影響見圖4。3種酵素能降低B16細胞胞內ROS相對產生率。在寧夏酵素中，除稀釋倍數為10和105濃度，其余各組均能顯著降低ROS產生量（p＜0.05）。在臺灣酵素中，除稀釋倍數為10，105，106和107濃度，其余各組均能顯著降低ROS產生量（p＜0.05）。在日本酵素中，少部分濃度能顯著降低ROS產生量。在稀釋倍數為102濃度下，臺灣和日本蔬酵素的ROS相對產生率分別0.86和0.90，寧夏果蔬酵素為0.60，相較于其他2種酵素，分別降低0.26和0.30，說明寧夏酵素具有更好的抗氧化能力。

圖4 3種果蔬酵素對B16細胞胞內ROS產生量的影響

3 結論

黑色素在黑色素細胞中的小型囊泡——黑素小體中合成并包裹轉運至角質細胞，攝取黑色素并顯色的角質細胞會向皮膚角質層上移，形成最終膚色[7]。美白功效的作用機制主要包括抑制酪氨酸酶活性，限制黑色素從黑素小體到角質細胞的轉移，清除自由基等[8-9]。當前主要是對酪氨酸酶活性和黑色素含量進行研究進而評價產品美白效果，而常用的評價模型有細胞模型、動物模型等。試驗采用B16細胞模型對產品進行美白功效的評價，B16細胞來源于高度轉移能力的鼠皮膚黑色素瘤，其基因組成與人表皮黑素細胞有較高的相似性，且較后者更易培養，是測試受試物對黑素細胞生物學功能影響的首選細胞模型[10]。結果表明，3種酵素對B16細胞均無毒性，且有美白作用，寧夏果蔬酵素的效果更明顯，在適當濃度下能顯著抑制酪氨酸酶活，降低胞內黑色素的含量，清除胞內ROS，提高抗氧化能力，為相關產品的后續研發奠定基礎并提供試驗依據。