北京地區南瓜病毒病病原種類鑒定

陳利達 曹金強 石延霞 柴阿麗 謝學文李寶聚

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

南瓜（Cucurbita moschata Duch.，中國南瓜）、筍瓜（Cucurbita maxima Duch. ex Lam.，印度南瓜）、西葫蘆（Cucurbita pepo L.，美洲南瓜）、墨西哥南瓜（Cucurbita mixta Pangalo）和黑籽南瓜（Cucurbita ficifolia Bouché）并列為世界上南瓜屬作物的5個栽培種（李昕升 等，2017）。南瓜因產量高、效益好，且具有一定的保健作用，成為我國北方地區菜糧兼用作物之一。據聯合國糧農組織（FAO）統計，2014年全世界南瓜產量約為2 519萬t，我國占世界當年總產量的28.74 %，居世界第1位（王璐，2017）。隨著南瓜種植規模的擴大，病毒病也愈發嚴重，成為制約南瓜產業發展的主要因素之一，尤其在高溫干旱的年份，嚴重影響南瓜的品質與產量。據報道，能夠侵染南瓜的病毒種類有80多種，其中小西葫蘆黃花葉病毒（Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、 南 瓜 花 葉 病 毒（Squash mosaic virus，SqMV）、番木瓜環斑病毒（Papaya ringspot virus，PRSV）和馬鈴薯Y病毒（Potato viurs Y，PVY）（Lecoq et al.，1997；Fletcher et al.，2000；周賢，2013；劉嘉峪 等，2017）發生相對普遍。

近年來北京地區南瓜的種植面積逐年增加，南瓜病毒病危害日趨嚴重，本文針對北京周邊地區采集的疑似感染病毒病的南瓜葉片，采用反轉錄PCR（RT-PCR）技術進行檢測，以期了解北京地區南瓜上主要病毒種類及其分布，為當地南瓜病毒病的防控和抗病品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2016～2017年，在北京周邊地區采集疑似感染病毒病的南瓜樣本（葉片）共84份：順義區32份、昌平區15份、大興區12份、海淀區25份。所采樣品均保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2 試劑與儀器

試劑：TRIzol Reagent購自英濰捷基（上海）貿易有限公司；反轉錄試劑盒FastQuant RT Kit購自天根生物科技（北京）有限公司；2×Taq Mix（MT201）購自博邁德科技（北京）有限公司。

儀器設備：3K15型高速離心機，德國Sigma公司生產；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠生產；移液槍，德國Eppendorf公司生產；Jel Doc 2001型凝膠成像系統、Bio-Rad S1000 PCR儀，美國伯樂公司生產。

1.3 植物總RNA提取

采用TRIzol法提取南瓜葉片總RNA。取100 mg南瓜葉片于液氮中研磨，將0.2 g粉末轉入1.5 mL離心管，迅速加入1 mL TRIzol試劑，振蕩混勻，室溫下靜置5 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；將上清液轉入1.5 mL離心管，加入0.2 mL氯仿混勻，室溫放置5 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；取水相（約400 μL）加入等體積的異丙醇，室溫下靜置10 min；4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min；棄上清液，加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀2次，4 ℃下12 000 r·min-1離心5 min；自然干燥，加入50 μL RNase-Free ddH2O溶解；以健康南瓜葉片總RNA為陰性對照，-80 ℃保存備用。

1.4 南瓜病毒病樣本RT-PCR檢測

以提取總RNA為模板，用FastQuant RT Kit試劑盒反轉錄合成病毒的cDNA第一條鏈。使用已報道的 CMV-F/CMV-R、SqMV-1/SqMV-2、PRSV-F/PRSV-R和PVY-1/PVY-2特異性引物（表1）對不同樣本進行RT-PCR擴增，其中ZYMV-1/2和WMV-1/2是根據GenBank已有的病毒外殼蛋白基因（Coat Protein，CP）序列所設計。所用引物均由博邁德科技（北京）有限公司合成。

表1 用于南瓜病毒病分子檢測的引物信息

PCR擴 增 體 系：2×Taq PCR Master Mix 10 μL，上下游引物各 0.5 μL，cDNA模板 1 μL，ddH2O補足至20 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性 30 s，53 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共34個循環；72 ℃補充延伸10 min。擴增結束后，取5 μL PCR產物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用全自動凝膠成像系統記錄結果。PCR產物送至博邁德科技（北京）有限公司進行測序，并利用NCBI序列比對工具BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）程序，根據核酸序列同源性確定病毒種類。

2 結果與分析

2.1 RT-PCR擴增結果

對采集的84份南瓜病毒病樣本（葉片）提取總RNA，利用不同特異性引物進行RT-PCR檢測，部分檢測結果見圖1。待測樣品中引物CMV-F/CMV-R可擴增出大小735 bp的條帶（圖1-a），引物ZYMV-1/ZYMV-2可擴增出大小582 bp的條帶（圖1-b），引物WMV-1/WMV-2可擴增出大小697 bp的條帶（圖1-c），陰性對照均未擴增出目的條帶。表明在待檢樣品中能分別測出CMV、ZYMV和WMV，但未檢測到SqMV、PRSV、PVY。

圖1 南瓜部分樣品RT-PCR檢測結果

2.2 南瓜主要病毒種類檢測結果

對采集的84份南瓜病毒病樣本進行PCR檢測，其中79份病樣檢測顯示陽性，檢出3種病毒分別為CMV、ZYMV和WMV，病毒檢出率94.05%。其中CMV檢出率最高，可達52.38%；其次為ZYMV，檢出率44.01%；WMV檢出率14.29%（表2）。因此，CMV在北京地區南瓜上侵染最普遍，為優勢病毒種類。

北京不同地區南瓜病毒種類及發生程度有所差異（表2）。在南瓜植株上檢出的病毒種類最多的是順義區和海淀區，檢測到3種病毒，這2個地區南瓜病毒病發生最為嚴重；其次是昌平區和大興區，分別檢測出2種病毒，該地區病毒病危害較輕。

表2 北京地區南瓜病毒種類及分布

2.3 南瓜植株上病毒的復合侵染情況

北京地區84份南瓜病毒病樣品中，發現14份病樣為2種病毒復合侵染，復合侵染率為16.67%（表3）。其中，北京順義區南瓜病毒病復合侵染種類為CMV和ZYMV，侵染率為18.75%；海淀區南瓜病毒病復合侵染種類為ZYMV和WMV，侵染率為32.00%，未檢出3種病毒復合侵染。

表3 北京地區南瓜病毒復合侵染類型及分布

2.4 北京地區南瓜病毒病田間癥狀

圖2 南瓜病毒病田間發病癥狀

南瓜病毒病的發生可貫穿植株整個生長發育期，為系統性侵染。北京地區南瓜病毒病主要包括花葉、褪綠和皺縮等癥狀，經室內分子檢測后得知田間病毒種類為CMV、ZYMV和WMV 3種。CMV田間癥狀（圖2-a）：葉片葉綠素分布不均，易出現黃色或淡黃色病斑。嚴重時葉片變小變脆，出現淺黃色部分斑駁，呈現黃綠分布不均的鑲嵌狀花葉癥狀。ZYMV田間癥狀（圖2-b）：葉面出現花葉及斑駁癥狀，部分葉肉逐漸褪綠黃化，易出現明脈。嚴重時植株矮化，節間變短，葉緣卷曲形成雞爪狀，并常伴有蕨葉及葉面凹凸起伏癥狀。WMV田間癥狀（圖2-c）：葉片變小變硬，葉緣部分失綠并伴有斑駁等癥狀。發病中后期植株表現皺縮矮化、葉片卷曲，發病嚴重時莖蔓變短，發病組織呈瘤狀突起。混合侵染的植株發病癥狀表現較為復雜，發病較重。CMV和ZYMV復合侵染后植株矮化，葉緣卷曲，葉片顏色變淺，出現蕨葉及葉面不平現象（圖2-d）。ZYMV和WMV復合侵染現象廣泛存在，其癥狀在葉片上表現明顯，葉片出現褪綠黃化，易形成深淺綠色相間花葉，伴有皺褶卷曲現象。有時葉緣處有斑駁突起，病株生長遲緩，開花結果后病情趨于加重（圖2-e）。

3 結論與討論

病毒病是制約南瓜生產的重要因素之一，隨著我國南瓜種植面積逐年增加，病毒病的危害日益加重，給南瓜生產造成嚴重的經濟損失。南瓜病毒病在我國長江地區、內蒙古、新疆、黑龍江等地普遍發生（馬英，2017）。不同地區引起南瓜病毒病的毒源種類不盡相同，新疆石河子地區南瓜病毒病毒源種類主要為CMV、ZYMV、WMV、PRSV-W（任琛榮 等，2016）；黑龍江地區南瓜病毒病的毒源種類為CMV和WMV（楊國慧，2003）。本試驗結果表明，侵染北京地區南瓜的主要毒源有CMV、ZYMV和WMV 3種，未檢測到SqMV、PRSV、PVY等其他病毒，由于病毒分布具有區域性，目前SqMV只在黑龍江南瓜上有相關報道（李鳳梅，2002）。其他病毒種類也未檢出，可能是由于采樣數量少或部分南瓜植株病毒癥狀表現不明顯，導致漏采。在所有檢測樣品中CMV的檢出率較高，可能是由于CMV寄主范圍廣，可侵染1 000多種單、雙子葉植物（王海河 等，2001），且CMV可由60多種蚜蟲進行非持久性傳播，因此成為北京地區南瓜病毒病優勢毒源。此外，本次采集樣本共84份，其中有79份病樣顯示陽性，5份疑似感染南瓜病毒病，但在該樣本內未檢測到病毒，可能是生理性病害或藥害所致。

瓜類病毒復合侵染現象在不同地區均有報道，部分學者對我國瓜類主產區進行病毒種類調查，發現存在多種病毒復合侵染現象，其中以PRSV和WMV組合最為常見，占復合侵染組合的31.25%（尤毅 等，2016）；重慶地區南瓜檢測樣品中有93.22%的樣品受2種以上病毒復合侵染（青玲 等，2010）。本試驗中2種病毒復合侵染率為16.67%，可能與連作、傳毒媒介、種子與土壤帶毒有關。尤其是昆蟲傳毒，CMV、ZYMV 、WMV均可通過蚜蟲進行傳播，部分蚜蟲可攜帶多種病毒進行再侵染，導致一種植株上出現2種或2種以上病毒復合侵染現象。也可能與病毒越冬習性有關，如國內學者在重慶地區對南瓜病毒病進行鑒定，發現農田周圍葎草上存在7 種病毒，且復合侵染的比例高達80%（青玲 等，2009）。CMV、ZYMV和WMV均為種傳病毒（楊國慧，2003），再加上田間管理不當、單一品種種植模式等，成為南瓜病毒病發生嚴重且存在復合侵染的主要原因。

本試驗已檢測出北京地區南瓜病毒病的毒源種類主要有CMV、ZYMV和WMV，但受采集數量和地域性的限制，無法涵蓋北京地區南瓜病毒所有種類，因此，是否存在其他病毒種類還有待進一步研究。

馮光惠，杜虎平，李夏隆，亢福仁.2014.陜北地區馬鈴薯Y病毒的RT-PCR檢測及其序列分析.山西農業科學，42（9）：941-944.

李鳳梅.2002.黑龍江省南瓜病毒病毒原鑒定和品種資源抗性篩選的研究〔碩士論文〕.哈爾濱：東北農業大學.

李昕升，吳昊，劉宜生.2017.南瓜屬作物與南瓜品種資源.中國野生植物資源，36（5）：1-6.

廖富榮，葉志紅，陳青，吳媛，陳紅運，林石明.2013.應用RTPCR和IC-RT-PCR方法檢測南瓜花葉病毒.植物檢疫，27（2）：60-64.

劉嘉裕，戴良英，劉勇，張德詠，譚新球，李迅，唐前君.2017.長沙地區南瓜的小西葫蘆黃花葉病毒檢測及其分子進化分析.湖南農業大學學報：自然科學版，43（3）：274-281.

馬英.2017.籽用西葫蘆病毒病發病流行原因分析及防治.中國蔬菜，（7）：86-88.

青玲，楊水英，孫現超，王進軍，周常勇.2009.從葎草中檢出復合侵染的多種病毒.植物保護，35（4）：138-139.

青玲，包凌云，周常勇，楊水英，孫現超.2010.重慶南瓜病毒病病原 ELISA 檢測及CMV變異分析.園藝學報，37（3）：405-412.

任春梅，程兆榜，楊柳，繆倩，周益軍.2015.江蘇省葫蘆科作物6種病毒的多重 RT-PCR 方法及應用.江蘇農業學報，31（4）：756-763.

任琛榮，郝小軍，都業娟，向本春.2016.新疆石河子及新湖籽用西葫蘆病毒病分子檢測.北方園藝，（1）：102-106.

宋婷婷，陳榮溢，楊雷亮.2007.應用多重RT-PCR 檢測煙草上的TMV和CMV.遼寧農業科學，（1）：53-54.

王海河，林奇英，謝聯輝，吳祖建.2001.黃瓜花葉病毒三個毒株對煙草細胞內防御酶系統及細胞膜通透性的影響.植物病理學報，31（1）：43-49.

王璐.2017.南瓜籽不同干燥方式及工藝對南瓜籽油功能性品質的影響〔碩士論文〕.北京：中國農業大學.

楊國慧.2003.滇黑兩省南瓜病毒病病原鑒定及其外殼蛋白基因克隆〔博士論文〕.哈爾濱：東北農業大學.

尤毅，李華平，謝大森.2016.侵染冬瓜的病毒病原種類鑒定.植物保護，42（2）：182-186.

周賢.2013.蘇丹首次報道南瓜感染番木瓜環斑病毒.植物檢疫，（3）：100.

Fletcher J D，Wallace A R，Rogers B T.2000.Potyviruses in New Zealand buttercup squash（Cucurbits maxima Duch.）：yield and quality effects of ZYMV and WMV 2 virus infections.New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，28（1）：17-26.

Lecoq H，Dafalla G，Desbiez C，Wipfscheibel C，Delecolle B.1997.Biological and molecular characterization of Moroccan Watermelon mosaic virus and a potyvirus isolate from Eastern Sudan.Plant Disease，85（5）：547-552.