DABS-Cl柱前衍生-HPLC法測定豆豉中的γ-氨基丁酸含量

丁素君，何新蕾

(漯河醫學高等專科學校化學教研室，河南 漯河 462002)

γ-氨基丁酸 (γ-aminobutyric acid，GABA) 為天然氨基酸，為重要的抑制性神經遞質，具有降血壓、鎮靜和改善腦、肝、腎等生理功能。而GABA可通過微生物提供的谷氨酸脫羧酶對谷氨酸進行脫羧產生[1]。而傳統發酵豆豉含有豐富的谷氨酸，通過微生物發酵可獲得足夠量的 GABA，但由于工藝不同，差異也挺大，因此了解不同豆豉中的GABA含量是必要的[2]。目前，GABA的測定方法較多，包括比色法、電泳法、氣相色譜法以及液相色譜法，其中由于GABA對電化學和紫外-可見光靈敏度低，HPLC需要進行柱前衍生[3]。而柱前衍生劑有異硫氰酸苯酯(PITC)、鄰苯二甲醛(OPA)-巰基乙醇、6-氨基喹啉基-N-羥基-琥珀酰亞胺基甲酸酯(AQC)等，其中OPA衍生產物不穩定，且自身帶有一定的刺激性氣味，AQC水解后產物易產生干擾峰[4]。本實驗重點分析采用磺酰氯二甲胺偶氮苯(DABS-Cl)作為柱前衍生劑，采用HPLC快速、準確測定豆豉中γ-氨基丁酸水平。

1 實驗部分

1.1 儀器與設備

柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) Waters公司；TGL-16C 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；Sartorius Bp211D 電子天平 德國Sartorius。

1.2 試劑與材料

γ-氨基丁酸標準品：購自美國Sigma公司；磺酰氯二甲胺偶氮苯：購自Supecol公司；甲醇、乙腈均為HPLC級；水為超純水。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

重慶永川豆豉冷凍干燥、粉碎，過40目，精確稱取 0.5 g 凍干粉，加入20.0 mL 10%的三氯乙酸，渦旋2 min，45 ℃水浴中超聲輔助提取2 h，3000 r/min離心10 min，取上清， 0.45 μm纖維素膜過濾，備用。

1.3.2 衍生條件

精密量取樣品液100 μL，冷凍干燥，0.1 mol/L碳酸鹽體系(pH為9.0)復溶，4 mmol/L 的DABS-Cl衍生劑溶液(DABS-Cl 129.5 mg、乙腈10 mL)100 μL，混勻，70 ℃恒溫水浴中反應20 min，加300 μL終止液(150 μL 40 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH為6.5，150 μL無水乙醇)，混勻，3000 r/min 離心10 min，取上清,0.45 μm濾膜過濾，20 μL進樣。

1.3.3 色譜條件

695型液相色譜儀帶二極管陣列檢測器；默克RP C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A：(乙腈∶甲醇為75∶25)流動相B：(0.04 mmol/L 醋酸鈉，pH為7.3) ；柱溫：35 ℃；進樣體積20 μL；流速：0.8 mL/min；檢測波長：430 nm；洗脫條件：0～10 min，75%A；10～25 min，60%A；25～26 min，45%A；26～30 min，25%A。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

圖1 γ-氨基丁酸波長掃描圖

由圖1可知，γ-氨基丁酸衍生后在300～450 nm的吸收光譜，其中430 nm處吸收峰較高，故選擇430 nm為檢測波長。

2.2 分離效果

本色譜條件能將γ-氨基丁酸與其他氨基酸做到基線分離，干擾小，見圖2。

圖2 γ-氨基丁酸色譜圖

2.3 衍生條件的優化

考察了不同的pH、溫度和衍生時間對γ-氨基丁酸測定的影響。結果顯示：pH為9.0，70 ℃反應20 min后，峰面積最大，見表1～表3。

表1 pH對γ-氨基丁酸衍生的影響

表2 溫度對γ-氨基丁酸衍生的影響

表3 衍生反應時間對γ-氨基丁酸衍生的影響

2.4 標準曲線和重復性

0.1 mol/L pH 9.0碳酸鹽體系配制濃度分別為24.00，12.00，6.00，3.00，1.50 μg/mL的GABA對照品溶液和4 mmol/L的DABS-Cl衍生劑溶液，于70 ℃反應20 min，加入300 μL衍生反應終止液，進樣測定峰面積，以γ-氨基丁酸為橫坐標，峰面積為縱坐標制作標準曲線。得γ-氨基丁酸線性方程為：Y=2.48063X×105+1.52957×105(r=0.9997)，可見γ-氨基丁酸在(1.50～24.00 μg/mL)濃度范圍內線性關系良好。

精密吸取樣品溶液6份，每份100 μL，參照1.3.2制備衍生溶液，進樣，記錄峰面積，測定γ-氨基丁酸的含量，結果顯示：γ-氨基丁酸的平均含量為16.22 μg/mL，RSD值為3.17%，表明方法重復性良好。

2.5 精密度試驗

精密吸取衍生后同期重慶永川豆豉樣品溶液20 μL，連續進樣6次，結果γ-氨基丁酸峰面積RSD值為1.51%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

精密吸取衍生后同期重慶永川豆豉樣品溶液20 μL分別在0，4，8，12，24 h進樣，測定峰面積，結果峰面積的RSD值為1.12%，表明衍生后樣品溶液在24 h內基本穩定。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的同期重慶永川豆豉樣品0.25 g凍干粉，平行試驗9份，分別加入γ-氨基丁酸適量，按1.3.1和 1.3.2制備樣品后，進樣測定峰面積，并計算加樣回收率，見表4。γ-氨基丁酸平均加樣回收率為100.83%，RSD值為2.25%，結果表明加樣回收率試驗良好。

表4 γ-氨基丁酸加樣回收率試驗

續 表

2.8 實際樣品的檢測

對市售5類豆豉中的 GABA 含量進行了測定，陜西商洛豆豉255.4 mg/kg，四川黃豆豆豉147.5 mg/kg，廣東陽江豆豉551.4 mg/kg，重慶永川豆豉648.9 mg/kg，湖北豆豉1461.0 mg/kg。

3 結論

本研究建立了DABS-Cl柱前衍生-HPLC測定豆豉中γ-氨基丁酸的方法，該方法檢測結果不會受到氨基酸DABS-Cl衍生物的影響，并且能做到γ-氨基丁酸與其他氨基酸基線分離，干擾小，適用性更強，準確、可靠，可用于對該類豆制品物質的測定。

參考文獻：

[1]楊曦,劉玉潔,馬慧娟，等.γ-氨基丁酸與糖尿病[J].國際內分泌代謝雜志,2017,37(1):45-47.

[2]馬艷莉,盧憶,張曉陽，等.腐乳發酵過程中γ-氨基丁酸變化規律研究[J].中國食物與營養,2013,19(5):27-30.

[3]趙燕燕,王艷,劉麗艷，等.化學物質衍生-同步熒光法測定注射液中γ-氨基丁酸的含量[J].河北大學學報(自然科學版),2013,33(1):35-41,52.

[4]涂云飛,楊秀芳,張士康，等.柱前衍生高效液相色譜法測定茶葉中茶氨酸及y-氨基丁酸[J].色譜,2012,30(2):184-189.