體外誘導沙眼衣原體持續性感染對宿主細胞凋亡的調控

陳文韜 薛耀華 黃進梅 楊結儀 趙云虎 藍銀苑 方銘恒 鄭碧英 鄭和平

510000廣州，南方醫科大學皮膚病醫院 廣東省皮膚病醫院檢驗科（陳文韜、薛耀華、黃進梅、趙云虎、藍銀苑、方銘恒、鄭和平）；廣東醫科大學研究生學院（楊結儀、鄭碧英）

2008—2015年全國105個性病監測點生殖道沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，Ct）感染報告發病率由2008年的32.48/10萬增長到2015年的37.18/10萬［1］。臨床上10% ～ 15%的患者出現Ct再感染和持續性感染，成為治療面臨的一大難題［2］。Lewis等［3］在經首選藥物阿奇霉素治療的患者中發現Ct持續性感染的特征表現——異形包涵體。體外實驗發現，持續性感染在應激因素作用下產生，Ct處于存活但不繁殖狀態，具有更強的抵抗外界惡劣環境的能力；當應激因素去除后，又可恢復成急性感染，進而生長繁殖［4］。目前持續性感染被認為是造成臨床治療失敗的重要原因之一，但其產生的機制尚不清楚。調控宿主細胞凋亡是許多病原體建立感染的重要機制。研究證明，Ct通過多條途徑抑制宿主細胞凋亡，以利于其生長繁殖［5-8］。本研究研究阿奇霉素誘導Ct持續性感染對宿主細胞凋亡的影響，探討Ct持續性感染的發生機制。

材料與方法

一、主要試劑和細胞

人宮頸癌細胞株（Hela229）來自中國典型培養物保藏中心，D型Ct標準株獲贈于中國醫學科學院皮膚病研究所，阿奇霉素標準品為廣東省藥品檢驗所（純度94.4%）產品，DMEM培養液為美國Thermo Fisher Scientific公司產品，凋亡誘導劑星狀孢子素（staurosporine）為美國 Alexis Biochemicals公司產品，Ct直接免疫熒光檢測試劑盒產于愛爾蘭Trinity Biotech公司，膜聯蛋白V-碘化丙錠（Annexin V-PI）凋亡檢測試劑盒為美國BD Biosciences公司產品，Hoechst 33258產于廣州GBCBIO Technologies公司。

二、Ct持續性感染和急性感染細胞模型的構建及驗證

待鋪于6/24孔細胞板（含細胞爬片）內的Hela229細胞融合率達到80%時，加入D型Ct標準株，37℃、5%CO2培養箱中培養22 h，將DMEM培養液置換為含有0.08 mg/L阿奇霉素的DMEM培養液繼續培養至48 h，構建持續性感染細胞模型［9］。在感染22 h時，將DMEM培養液置換為新鮮的DMEM培養液（不含阿奇霉素），繼續培養至48 h，構建急性感染細胞模型。分別用免疫熒光和電鏡技術檢測Ct包涵體的形態和內部結構，免疫熒光技術方法如下：取出24孔板內的細胞爬片，丙酮固定細胞，磷酸緩沖液（PBS）漂洗，加入異硫氰酸熒光素（FITC）標記的抗Ct主要外膜蛋白（MOMP）的熒光抗體，室溫避光孵育15 min，經PBS漂洗后加入DAPI染料，室溫避光孵育15 min，PBS漂洗后熒光顯微鏡觀察。電鏡技術方法如下：用胰蛋白酶將6孔板內細胞消化后離心，用PBS漂洗2次，離心后加入4%戊二醛固定，電鏡檢測。持續性感染Ct包涵體內異形網狀體的存在可認為模型構建成功。

感染48 h去除含有阿奇霉素的DMEM培養液，PBS充分洗滌3次，置換新鮮培養液繼續培養至96 h，通過電鏡技術檢測Ct包涵體，以驗證Ct持續性感染細胞模型。

三、細胞凋亡實驗

構建急性感染和持續性感染模型，分別在感染24 h和48 h，對兩組細胞采用1 μmol/L STS處理，4 h后進行凋亡檢測。以未感染細胞為陰性對照，22 h更換新鮮培養液，在相同時間接受STS處理4 h后進行凋亡檢測。

用4%多聚甲醛固定細胞10 min，PBS漂洗，加入Hoechst 33258染色15 min，PBS洗滌、封片，熒光顯微鏡下觀察。同時用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶收集各組細胞，預冷的PBS緩沖液洗滌后，1×結合緩沖液調整細胞為1×106個/ml，同時加入Annexin V-FITC和PI，輕輕混勻并避光孵育15 min，1 h內流式細胞儀分析凋亡率。實驗重復3次。

四、統計學方法

采用SPSS20.0統計軟件，所有數據均用x±s表示，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、Ct持續性感染細胞模型的建立及驗證

Ct感染48 h，免疫熒光染色觀察，Hela229細胞內可見綠色熒光的Ct包涵體，急性感染模式中包涵體體積大（圖1A）；而由0.08 mg/L阿奇霉素誘導的Ct持續性感染包涵體呈固縮形，體積較急性感染組小（圖1B）。

電鏡觀察可見，Ct急性感染48 h時包涵體內含有大量原體（elementary body，EB）和少量網狀體（reticulate body，RB）（圖2A），而Ct持續性感染包涵體內為畸形網狀體，無EB存在（圖2B）。去除阿奇霉素作用繼續培養至96 h，Ct持續性感染包涵體內出現EB（圖2C）。

二、Ct急性感染和持續性感染調控Hela229細胞凋亡

圖1 沙眼衣原體包涵體免疫熒光染色（×400） 1A：急性感染；1B：持續性感染。綠色熒光示沙眼衣原體包涵體

圖2 沙眼衣原體包涵體電鏡檢測 2A：急性感染48 h包涵體；2B：持續性感染48 h包涵體；2C：持續性感染去除阿奇霉素后繼續培養至感染96 h時包涵體。圖中標尺=2 μm

感染24 h，STS誘導凋亡4 h后，Hoechst染色發現，急性感染和持續性感染組感染Ct的細胞均未出現凋亡（圖3A、3B），而未感染Ct的細胞出現不同程度核固縮、碎裂，高亮藍色凋亡小體（圖3F）。感染48 h經STS誘導凋亡后，部分急性感染的細胞染色質呈現一定程度的濃縮（圖3C），持續性感染的細胞未見凋亡（圖3D）。未經過STS處理的細胞，染色質均勻，未見濃聚（圖3E）。

流式細胞儀檢測結果見圖4及表1。急性感染組和持續性感染組24、48 h時細胞經STS處理4 h后，細胞凋亡率與未感染組相比，差異均有統計學意義（P＜0.01）；而急性感染組與持續性感染組相比，差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

討 論

體外研究發現，Ct在γ干擾素（IFN-γ）、青霉素、鐵缺乏、熱休克和單純皰疹病毒（HSV）共感染等應激因素作用下，將進入特殊的生長狀態——持續性感染，存活但不繁殖，呈異形包涵體；去除應激因素后又可恢復急性感染［10］。該狀態下，Ct對阿奇霉素耐受性顯著增加［11］。盡管目前阿奇霉素仍是治療Ct的首選藥物，但Meta分析顯示，其治療有效率已有所下降［12-13］。我們使用阿奇霉素作為誘導劑，成功構建Ct持續性感染Hela細胞模型，并通過去除阿奇霉素作用，使Ct持續性感染恢復急性感染，發現其包涵體內重新出現具有感染能力的EB。盡管阿奇霉素與青霉素同為抗生素，但兩者誘導Ct持續性感染的機制存在差異。青霉素可在感染早期誘導Ct持續性感染，而阿奇霉素無法在Ct感染早期誘導成功，其作用時間在EB向RB轉變的重要階段［9-10］。當去除阿奇霉素作用后，Ct需要一定時間才能恢復感染性，說明在阿奇霉素作用下Ct處于存活、無感染性的持續性感染狀態［9］。

圖3 Hoechst染色檢測星狀孢子素（STS）誘導Hela229細胞凋亡（×400） 3A：沙眼衣原體急性感染24 h；3B：沙眼衣原體持續性感染24 h；3C：沙眼衣原體急性感染48 h；3D：沙眼衣原體持續性感染48 h；3E：未經STS處理的未感染細胞；3F：經STS處理的未感染細胞。箭頭所示為發生凋亡的細胞染色質

圖4 流式細胞術檢測星狀孢子素（STS）處理4 h后Hela229細胞凋亡率4A：細胞在沙眼衣原體感染24 h凋亡情況；4B：細胞在沙眼衣原體感染48 h凋亡情況

細胞凋亡是宿主抗病原體感染的重要防御機制，而調控宿主細胞凋亡是病原體建立感染并順利生長繁殖的基礎。Ct作為嚴格胞內寄生病原體，通過獲取宿主細胞營養物質，調控宿主細胞凋亡維持自身穩定的生長環境［5-8］。在持續性感染狀態下Ct長期存活而不繁殖，其對宿主細胞凋亡的調控，也有利于其在機體免疫壓力下長期存活。有研究發現，衣原體對宿主細胞凋亡調控具有雙向性，可誘導宿主細胞凋亡，也可抑制宿主細胞凋亡，這一作用不僅與型別和菌株有關，同樣也與病原體載量有關［14］。早期研究表明，IFN-γ誘導的 Ct持續性感染可使細胞存活至感染120 h［15］。然而，不同應激因素引起的Ct持續性感染，衣原體在轉錄水平均存在差異［16］。為探討阿奇霉素誘導Ct持續性感染對宿主細胞凋亡的影響，我們在Ct持續性感染細胞模型基礎上，通過STS誘導宿主細胞凋亡，檢測Ct對宿主細胞凋亡的調控作用。

我們發現，在感染早期Ct急性感染和由阿奇霉素誘導的持續性感染均具有抗宿主細胞凋亡的能力。而在感染晚期，急性感染抵抗宿主細胞凋亡的能力消失，與Ct完成正常的生長周期后釋放EB感染新的細胞有關，這與Ying等［17］的研究結果相似。由阿奇霉素誘導的Ct持續性感染，則在感染48 h時仍具有抗宿主細胞凋亡的作用，這一現象也說明持續性感染在衣原體免疫逃逸方面具有重要作用，因為發生凋亡的細胞可被機體的吞噬細胞清除，而衣原體在處于凋亡抵抗的細胞內可長期存活。盡管這一現象與IFN-γ誘導Ct持續性感染對抗宿主細胞凋亡作用相似，但兩者調控機制和途徑可能不盡相同。

本研究成功構建由阿奇霉素誘導Ct持續性感染的細胞模型。由于阿奇霉素為臨床一線用藥，該模型將為進一步研究Ct持續性感染的發生機制提供有力條件。Ct持續性感染對宿主細胞凋亡的調控作用，在復雜的機體免疫環境下也可能存在其他機制，使其長期存活而不被清除。由于機體免疫的復雜性，臨床上持續性感染的產生僅與藥物作用有關，抑或由于藥物和機體免疫聯合作用，有待進一步探討。

表1 流式細胞儀檢測沙眼衣原體（Ct）急性和持續性感染Hela229細胞凋亡率（%，x±s）