penA和mtrR基因突變在體外誘導淋球菌對頭孢曲松耐藥作用的研究

其木格 董磊 張秀麗 張立忠 李艷飛 王杰

010017呼和浩特，內蒙古自治區人民醫院皮膚科（其木格、張秀麗、張立忠、李艷飛、王杰）；內蒙古醫科大學研究生院［董磊（現在鄭州大學附屬鄭州中心醫院皮膚科）］

頭孢曲松是治療淋病的一線藥物，但近年來對頭孢曲松敏感性下降或耐藥的淋球菌在全球多個國家和地區出現［1-3］，亦有數個頭孢曲松治療咽部淋球菌感染失敗的報道［4-5］。我國目前尚無頭孢曲松耐藥相關的淋病治療失敗報道，但頭孢曲松低敏的淋球菌陽性率逐年升高［6-7］。淋球菌對頭孢菌素低敏或耐藥的分子機制涉及青霉素結合蛋白2基因（penA）、調節MtrCDE外排泵功能的基因（mtrR）、孔蛋白基因（porB/penB）、青霉素結合蛋白1基因（ponA）以及pilQ基因等在內的多個耐藥基因決定子以及其他未知的耐藥基因，其中編碼青霉素結合蛋白2（PBP2）轉肽酶的penA基因突變起主導作用［8］。為進一步探討penA和mtrR基因突變在淋球菌對頭孢曲松耐藥機制中的作用，我們通過對原代及子代耐藥淋球菌株penA和mtrR基因測序，了解靶位基因突變與菌株耐藥的關系。

一、材料與方法

1.菌株來源：所用4株淋球菌均由中國醫學科學院皮膚病研究所性病實驗室提供，體外次抑菌濃度誘導頭孢曲松耐藥過程亦在該實驗室完成。1株為標準菌株ATCC-49226（頭孢曲松敏感菌株），3株為臨床分離株，分別為頭孢曲松低敏菌株（2012-5616）、頭孢曲松敏感菌株（2012-4052和2012-15361）。4株菌均經糖發酵試驗確認，藥物敏感性試驗已在前期完成［9］，菌株的藥物敏感性特征見表1。

2.主要試劑：頭孢曲松鈉標準粉為美國Sigma公司產品，淋球菌培養基GC基礎粉和增菌劑（1%IsoVitaleX）均為美國BD公司產品，淋球菌氧化酶、DNA提取液、PCR試劑、引物等由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，基因測序由北京博邁德基因技術有限公司完成。

3.體外次抑菌濃度誘導試驗：將選取的4株試驗菌株進行頭孢曲松體外次抑菌濃度（1/2最低抑菌濃度，1/2 MIC）誘導，在36℃、5%CO2及80%濕度條件的培養箱中培養，24 h時于抗生素培養基轉種傳代1次，待菌株生長穩定后，連續傳代培養，MIC濃度依次遞增為1/2、1、2、4、8、16……直至最后1次的培養基上有菌落穩定生長（MIC≥1 mg/L）。在無抗生素培養基中繼續傳代培養耐藥突變菌株，研磨洗脫于20%甘油的胰酶大豆肉湯凍存培養基中，-70℃冰箱保存備用。

4.penA和mtrR基因引物：采用Lee等［10］設計的引物，penA基因片段較長，將其分成3個片段penA-1、penA-2和penA-3，測序后再用基因軟件DNAStar進行拼接分析。引物序列見表2。

5.penA和mtrR基因測序：提取誘導前原代菌株及誘導后子代耐藥菌株的DNA進行PCR擴增，反應總體系50 μl，其中緩沖液5 μl，dNTP 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA模板1 μl，DNA聚合酶（Taq酶）0.3 μl，雙蒸水 41 μl；反應條件：95℃預變性1 s，94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環。擴增產物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統觀察并照相。之后將ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導前后的原代和子代耐藥株的DNA擴增產物純化后進行測序。

表1 研究所用4株淋球菌菌株的藥物敏感性

表2 penA和mtrR基因引物序列

二、結果

1.4株耐藥淋球菌的PCR結果：ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導前后均有目的基因表達，penA基因分段擴增出的陽性片段長度分別為620、580和870 bp，mtrR基因為400 bp。見圖1。

2.體外次抑菌濃度誘導試驗結果：ATCC-49226從1/2 MIC誘導至64 MIC產生耐藥共誘導了28代，臨床低敏菌株2012-5616誘導至4 MIC共傳代了26代，臨床敏感菌株2012-15361誘導至16 MIC共傳代了36代，臨床敏感菌株2012-4052誘導至16 MIC共傳代了22代。見表3。

圖 1 淋球菌株 ATCC-49226、2012-5616、2012-4052、2012-15361誘導耐藥前后penA和mtrR基因凝膠電泳圖 -：陰性對照；M：標準參照物

3.基因測序結果：

（1）penA基因測序結果：ATCC-49226誘導耐藥前PBP2序列為標準序列，2012-5616、2012-4052、2012-15361菌株誘導前后以及ATCC-49226誘導后耐藥菌株的PBP2序列都是ⅩⅧ序列（含A501T和G542S）；ATCC-49226誘導耐藥后在penA編碼區發生A501T、G542S突變，另3株菌誘導后penA基因均未出現新的突變位點；未檢測到penA鑲嵌狀結構模式。penA基因測序獲得的波形圖符合標準基因測序分析的要求。見圖2。

（2）mtrR基因測序結果：2012-5616和ATCC-49226菌株在誘導前后均為A39T突變模式，2012-15361菌株誘導前后均無突變，2012-4052誘導后耐藥菌株在mtrR編碼區發生A39T突變。

三、討論

淋球菌對頭孢曲松耐藥涉及多個耐藥基因決定子及其相互作用，包括penA基因、mtrR基因等［8］。penA的鑲嵌狀突變模式和非鑲嵌狀penA的A501位的突變被證實與頭孢曲松的耐藥相關［11-13］。mtrR基因表達主要與淋球菌外排系統有關，發生突變時可以導致mtrCDE外排泵系統表達增加，使淋球菌內部有效藥物濃度下降而引起耐藥［14］。

Unemo等［15］研究臨床分離的高度耐頭孢曲松淋球菌菌株H401，發現含有penA-CI鑲嵌狀結構，該結構同時合并PBP2發生A501P突變，可能引起淋球菌對頭孢曲松敏感性下降。Sethi等［16］對大樣本臨床敏感淋球菌進行MIC檢測及penA基因測序分析發現，所有敏感菌株未發現鑲嵌狀結構及PBP2的A501突變，從而認為鑲嵌狀結構或PBP2的A501突變可能只發生在淋球菌對頭孢曲松低敏或耐藥的菌株。Lee等［10］對46株頭孢克肟和頭孢曲松敏感性降低的淋球菌進行測序分析發現，頭孢菌素敏感性降低的大多數菌株，penA突變模式以A501V突變為主。Olsen等［17］對2011年越南地區收集的淋球菌進行藥敏及耐藥基因研究顯示，78%的淋球菌PBP2的A501位氨基酸出現突變，其中A501V突變模式占44%，A501T突變模式占34%。還有研究發現，A501突變和G542S與非鑲嵌狀PBP2菌株的頭孢曲松耐藥或敏感性下降有關［18-20］。我們的研究中，頭孢曲松敏感菌株誘導耐藥后出現A501T和G542S突變，提示penA基因中的A501T和G542S突變可能在頭孢曲松耐藥中起重要作用。

Liao等［21］對淋球菌臨床敏感菌株及低敏菌株研究發現，當mtrR基因編碼區特定位點突變（如A39T、G45D）和（或）啟動子區的13 bp反向重復序列的單堿基A缺失突變時，MtrR蛋白減少，引起MtrCDE外排泵系統過度表達，增加藥物外排，從而導致包括頭孢曲松在內的抗生素敏感性下降。我們的研究中，菌株2012-5616（頭孢曲松低敏并對青霉素、四環素、阿奇霉素和環丙沙星耐藥）和ATCC-49226（頭孢曲松和環丙沙星敏感，但對青霉素、四環素和阿奇霉素低敏）在誘導前已出現A39T突變；而菌株2012-4052（頭孢曲松敏感，對四環素和環丙沙星耐藥，對青霉素和阿奇霉素低敏）只在誘導耐藥后在mtrR編碼區發生A39T突變。這些結果提示，在mtrR編碼區發生A39T突變可能在頭孢曲松耐藥中發揮作用，另外，mtrR基因可能與多重耐藥相關。

表3 4株淋球菌誘導耐藥前后頭孢曲松最低抑菌濃度（MIC）變化情況

圖2 penA基因片段測序波形圖

本研究中penA、mtrR基因主要是針對體外誘導頭孢曲松耐藥菌株進行的研究，很遺憾未能進行臨床分離頭孢曲松耐藥菌株的基因突變的研究。

綜上所述，penA基因中的A501T和G542S突變可能在頭孢曲松耐藥中起重要作用；而mtrR基因發生A39T突變的作用有待于進一步研究。

志謝中國醫學科學院皮膚病研究所性病科蘇曉紅教授及性病實驗室樂文靜、李賽等