益氣潤目湯對干眼小鼠眼表組織IL-1β及P-JNK表達(dá)的影響

張?jiān)?，亢澤峰 ，劉健 ，劉彥江

干眼是多種因素、多環(huán)節(jié)共同參與的病理過程。有研究表明高滲、干燥等環(huán)境能激活角結(jié)膜上皮絲裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase,MAPK）（尤其是 p38/P-JNK）通路，進(jìn)一步促進(jìn)多種促炎因子如白細(xì)胞介素（IL-1α、IL-1β、IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosisfactor-α,TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶 （matrix metalloproteinases,MMPs）等的分泌，局部炎癥反應(yīng)放大，損害局部角結(jié)膜組織及正常的淚液分泌，影響淚液分泌的質(zhì)和量，引發(fā)干眼[1-3]。通過免疫調(diào)節(jié)和抗炎治療干眼具有較好的前景。

自擬益氣潤目湯是以黃芪、當(dāng)歸為主的中藥組方。前期臨床研究中我們將中國中醫(yī)科學(xué)院眼科醫(yī)院收治符合干眼診斷標(biāo)準(zhǔn)的113例患者，隨機(jī)分為治療組和對照組，治療組59例（109只眼），對照組54例（104只眼）。治療組采用益氣潤目湯內(nèi)服聯(lián)合外部熏蒸治療干眼，對照組采用單純局部滴用玻璃酸鈉滴眼液治療。根據(jù)主觀癥狀和基礎(chǔ)淚液分泌試驗(yàn)、淚膜破裂時間、角膜熒光素鈉染色等檢查進(jìn)行評分，治療觀察4周。證實(shí)益氣潤目湯內(nèi)服聯(lián)合局部熏蒸對干眼具有明顯治療效果，不僅能改善患者眼部不適，且能改變干眼所致的病理改變，能延緩及促進(jìn)損傷眼表組織的修復(fù)。但其機(jī)制并不明確，因此結(jié)合目前炎癥在干眼發(fā)病中的作用，本實(shí)驗(yàn)試圖驗(yàn)證該方是否是通過抑制眼表炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)眼表屏障、穩(wěn)定淚膜、治療干眼的效果，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料及方法

1.1 主要試劑及材料

SPF級Balb/c健康小鼠，鼠齡6～8周，雌性，體質(zhì)量18～22 g，購自于北京芳元緣養(yǎng)殖場[SCXK（京）2009-0017]。氯化鈉粉劑、0.9%的氯化鈉注射液、酚紅棉線、5%熒光素鈉溶液、Trizol試劑（美國Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Invitrogen公司，Lot No-1416528）、Taq 酶（北京 Promega 公司，M166BS）、兔抗多克隆抗體白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）、磷酸化氨基末端蛋白激酶（P-JNK）抗體（博奧森 bs-1640R，Lot140224）、聚合辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗兔IgG（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）、免疫組化檢測試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司，Lot No-09D04A）、DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）、中性樹膠（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）。

1.2 藥物

益氣潤目湯（黃芪36 g、當(dāng)歸10 g、淡竹葉10 g、蟬蛻 6 g、谷精草 10 g、金銀花 10 g、山茱萸 18 g、升麻6 g），購自四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，低、中、高劑量組按人與動物用藥換算表配置。玻璃酸鈉滴眼液（德國EUSAN GmbH公司，生產(chǎn)批號281053）。高滲鹽水配置[5]：用0.9%氯化鈉溶液加氯化鈉粉劑配制成500 mOsmol/L氯化鈉溶液。

1.3 動物造模、分組及給藥

依據(jù)李晶等[6]使用高滲鹽水建立干眼小鼠模型的方法造模。于實(shí)驗(yàn)第0天除空白組外，各組均使用高滲鹽水點(diǎn)雙眼，每日5次（8時、10時、13時、15時、17時），點(diǎn)藥14 d。檢查小鼠造模后的淚液分泌、角膜熒光素染色情況，以確定是否造模成功。誘導(dǎo)失敗者剔除出組，成功誘導(dǎo)的干眼小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表的方法，隨機(jī)分組，模型組繼續(xù)點(diǎn)眼14 d，方法同前，維持干眼狀態(tài)，中藥高、中、低劑量組（0.754 g·ml-1，0.377 g·ml-1，0.188 g·mL-1） 給予高滲鹽水點(diǎn)眼聯(lián)合益氣潤目湯中藥顆粒劑灌胃，西藥組給予高滲鹽水聯(lián)合玻璃酸鈉滴眼液點(diǎn)雙眼 （每日4次，1滴/次）干預(yù)14 d。空白對照組等量生理鹽水灌胃14 d。

1.4 觀察IL-1β、P-JNK表達(dá)的方法

分別于治療后第7天、第14天，每組取6只小鼠，處死后將彎鑷從外眥部垂直探入，至眼球下方夾住視神經(jīng)，平行向上提起，摘除眼球，石蠟包埋包括角、結(jié)膜組織的完整的眼部組織，切片，備用，行免疫組化，陽性表達(dá)情況用Image-proplus 5.1圖像分析軟件進(jìn)行免疫組化圖像分析，計(jì)算IL-1β、P-JNK表達(dá)的平均光密度值；同時間點(diǎn)，各組剩余4只小鼠，同上法摘取眼球后，剪除后節(jié)部分，保留角膜結(jié)膜等眼表組織稱重，按照Trizol說明書法提取角結(jié)膜組織的RNA，行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) （reverse tran-scription PCR,RT-PCR）檢測眼表組織中IL-1βmRNA的水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析比較同一時間點(diǎn)不同組間IL-1β、P-JNK表達(dá)的差異，兩兩比較采用LSD法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 角膜IL-1β、P-JNK表達(dá)的檢測

在 400倍光學(xué)顯微鏡下觀察，角膜 IL-1β、P-JNK表達(dá)成棕黃或黃色，空白對照組見少量表達(dá)（圖 1，圖 2），干眼模型組小鼠的 IL-1β、P-JNK 有顯著增高。治療7d及14d各治療組IL-1β、P-JNK表達(dá)均低于模型組（P＜0.05），中藥中劑量組的數(shù)值在三個劑量組中最低，與同期西藥組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異（P＜0.05），結(jié)果詳見表 1、表 2。

表1 各組小鼠治療后不同時間角膜組織中IL-1β表達(dá)的光密度值比較（xˉ±s）

表2 各組小鼠治療后不同時間角膜組織中P-JNK表達(dá)的的光密度值比較（xˉ±s）

2.2 PCR檢測角結(jié)膜IL-1βmRNA表達(dá)水平

凝膠成像系統(tǒng)下見到目的基因和內(nèi)參基因條帶如圖3所示，IL-1βmRNA在各組中均有表達(dá)，目的條帶IL-1β位于273 bp、管家基因β-actin條帶位于364 bp。 治療 7 d、14 d，各治療組 IL-1βmRNA 表達(dá)水平較干眼模型組明顯減少（P＜0.05），但高于空白對照組。結(jié)果詳見表3。

表3 各組小鼠治療后不同時間角結(jié)膜上皮中IL-1βmRNA的相對表達(dá)比較（xˉ±s，IL-1β mRNA/β-actin mRNA）

圖1 免疫組化檢測IL-1β在角膜組織中 的表達(dá)（×40）。1A.空白對照組，1B.干眼模型組，1C.益氣潤目湯中劑量組 IL-1β：白細(xì)胞介素-1β 圖2 免疫組化檢測P-JNK在角膜組織中的表達(dá)（×40）。 2A.空白對照組，2B.干眼模型組，2C.益氣潤目湯中劑量組 P-JNK：磷酸化氨基末端蛋白激酶

圖3 各組小鼠治療后不同時間角結(jié)膜組織中β-actin mRNA及IL-1βmRNA表達(dá)的電泳圖。A.空白對照組，B.干眼模型組，C.益氣潤目湯高劑量組，D.益氣潤目湯中劑量組，E.益氣潤目湯低劑量組，F(xiàn).玻璃酸鈉滴眼液組 IL-1β：白細(xì)胞介素-1β

3 討論

干眼是一種常見的眼表疾病，目前主要采用局部人工淚液替代、抗炎、免疫抑制劑、局部物理療法及手術(shù)治療等，但遠(yuǎn)期療效不理想。中醫(yī)注重整體觀念，采用辨證論治理論，因人因時因地制宜，通過對人體臟腑功能的調(diào)節(jié)及外邪內(nèi)熱的祛化，不僅能改善臨床癥狀，更能從根本上達(dá)到治愈效果。

近些年關(guān)于本病的病因及機(jī)制研究屢見不鮮，治療方面也改變了傳統(tǒng)的對癥治療，開始重視對病因的把握，注重從發(fā)病機(jī)制著手尋求更科學(xué)的治療方案。目前眾多醫(yī)家傾向于“炎癥是其發(fā)病的關(guān)鍵因素[7]，淚膜穩(wěn)定性下降是其發(fā)病的共同通道”這一說法，且此類炎癥是非感染性免疫相關(guān)炎癥?？寡妆患{入干眼治療規(guī)范。近日在美國波士頓召開的美國白內(nèi)障與屈光手術(shù)協(xié)會的年會（ASCRS）上，一種名為EBI-005的新型IL-1受體拮抗劑受到參會專家的關(guān)注。報(bào)告稱IL-1在疾病引發(fā)的炎癥反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，包括干眼。

部分醫(yī)家經(jīng)過觀察，發(fā)現(xiàn)干眼患者淚液和結(jié)膜上 皮 中 的 多 種 細(xì) 胞 因 子 包 括 IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和TGF-β的水平較正常人有顯著改變，且與干眼的嚴(yán)重程度相關(guān)[7]。IL-1是一種重要的炎癥介質(zhì)，主要有兩種前體形式（IL-α 和 IL-β），具有多種生物學(xué)功能。IL-1是IL-6和TNF-α等其他炎癥因子的強(qiáng)力誘導(dǎo)物，能夠通過多種機(jī)制擴(kuò)大固有的免疫應(yīng)答；同時IL-1與TNF-α能促進(jìn)金屬基質(zhì)蛋白酶MMPs（MMP-9，MMP-1，MMP-13）在角膜上皮中的表達(dá)，通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、參與組織重構(gòu)、解除細(xì)胞間的黏附及促進(jìn)炎癥細(xì)胞間的遷移而破壞角膜屏障及淚膜的穩(wěn)定性[8-10]，影響淚液的質(zhì)、量，促使干眼發(fā)生。若能有效抑制炎癥因子的表達(dá)，在一定程度上就可達(dá)到保護(hù)眼表屏障（角結(jié)膜組織完整），保證淚液的分泌，終止干眼進(jìn)程的效果。

本研究所用的益氣潤目湯，主要由黃芪、當(dāng)歸、山茱萸、淡竹葉、金銀花、蟬蛻、升麻、谷精草共8味藥組成，臨床上加減化裁。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實(shí)黃芪可明顯增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能，調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫和體液免疫，是一種很有活力的雙向免疫調(diào)節(jié)劑，在免疫性疾病的治療方面有一定效果，既能預(yù)防超敏反應(yīng)性疾病的發(fā)生，又可調(diào)整自身免疫病患者的免疫應(yīng)答。能顯著下調(diào)TNF-α的mRNA基因表達(dá)，降低血漿中TNF-α水平，并使超氧化物歧化酶（SOD）合成增多，從而對組織細(xì)胞起到保護(hù)作用[4]。當(dāng)歸[5]有抗炎、清除氧自由基、保肝利膽、保護(hù)腎臟、增強(qiáng)免疫功能等作用。

前期的臨床及實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)自擬益氣潤目湯的療效[11]，明顯提高了淚液的質(zhì)與量，穩(wěn)定淚膜，但其機(jī)制并不明確，我們采用的高滲鹽水誘導(dǎo)干眼模型，操作方便，能保證眼球組織完整的前提下模擬人類干眼的體征及病理改變，從分子基因水平研究益氣潤目湯可能的機(jī)制。

通過本研究表明，正常角結(jié)膜組織中炎癥相關(guān)因子的含量低，當(dāng)外界環(huán)境遭到破壞（干燥、滲透壓升高）或角膜屏障失去完整結(jié)構(gòu)，炎癥因子效應(yīng)會逐級增大，擴(kuò)大局部反應(yīng)，致使淚膜穩(wěn)定性下降，發(fā)生干眼。本研究PCR及免疫組化結(jié)果顯示，給予益氣潤目湯治療后角結(jié)膜組織中炎癥相關(guān)因子IL-1β、P-JNK表達(dá)有明顯下降，且中劑量組下降明顯優(yōu)于其他組，說明該方可能通過抑制角結(jié)膜組織中的炎性因子表達(dá)，減輕局部炎癥反應(yīng)，保護(hù)眼表屏障完整，維護(hù)淚液分泌的質(zhì)與量，達(dá)到治療干眼的效果。本研究中的中藥制劑是否可以影響眼表細(xì)胞的凋亡，各炎癥因子之間的關(guān)系是否存在協(xié)同或?qū)梗欠駥に?、神?jīng)傳導(dǎo)存在作用等，需要我們進(jìn)一步研究。

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