MYBL2和p53在胃癌組織中的表達及臨床意義研究

盧洪勝 曹學全 包衛光 章輝 周璐青 於櫻枝

胃癌是全球發病率第5位的惡性腫瘤，在腫瘤死亡率中居第3位[1]。由于晚期胃癌患者復發和轉移率高，且缺乏有效的治療策略，因此預后較差[2]。此外，胃癌侵襲和轉移的分子機制仍不清楚。因此，識別新的轉移相關基因和闡述其潛在的機制可能為抗癌治療提供潛在的靶點。MYBL2基因，也被稱為B-myb，是MYB轉錄因子家族成員之一，在所有增殖細胞中廣泛表達[3]。MYBL2在細胞周期進展、細胞存活和細胞分化過程中起作用，提示MYBL2失調可能具有致癌潛能。MYBL2在乳腺癌、大腸癌和食管癌等多種實體癌中過表達，且與患者預后不良有關[4-6]。研究證實，MYBL2在p53基因突變的腫瘤中不成比例的上調，甚至在p53突變的細胞中可以克服DNA損傷誘導G2期阻滯[7]。目前胃癌組織中MYBL2和p53蛋白聯合表達的臨床意義研究鮮見報道。本研究采用組織芯片結合免疫組化En Vision法檢測88例胃癌和相應癌旁組織中MYBL2和p53蛋白的表達差異，分析MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素的關系，以及胃癌組織中MYBL2和p53蛋白表達的相關性，初步探討MYBL2和p53蛋白異常表達在胃癌發生、進展中的臨床意義及兩者之間的關系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2013年1月至2017年7月間行根治手術的88例胃癌切除標本，均具有完整的臨床病理資料，患者術前均未接受放射和化學治療，術后均經病理證實。腫瘤組織均取自腫瘤中心非壞死部分，同時取距離腫瘤＞5cm相應的癌旁正常黏膜組織作為對照。88例胃癌患者中男58例，女30例，年齡32~78（66.26±12.35）歲。組織學分級：高分化9例，中分化30例，低分化49例。根據2016年國際抗癌聯盟第8版TNM分期標準：I期10例，Ⅱ期25例，Ⅲ52例，Ⅳ期1例。浸潤深度（T分期）：T19例，T212例，T32例，T465例；淋巴結轉移情況（N分期）：N019例，N114例，N221例，N334例。所有組織標本取出后迅速用10%中性甲醛溶液固定，常規脫水、石蠟包埋。

1.2 主要試劑 鼠抗人MYBL2單克隆抗體購自美國Abnova公司，鼠抗人p53單克隆抗體購自美國Sigma公司，即用型羊抗鼠免疫組化En VisionTM檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術有限公司。

1.3 組織芯片的制作 對所有供體組織蠟塊行常規病理切片后HE染色，由2位病理科副主任醫師進行診斷，并在顯微鏡下找到典型病變部位作標記。利用組織芯片制作儀在受體蠟塊上打直徑1mm的孔，根據HE切片上標記的病變部位，然后在供體組織蠟塊上的對應位置獲取同樣大小直徑的組織芯，插入受體蠟塊陣列孔中，并記錄組織編號，重復上述步驟制成陣列塊，以4~5μm厚度連續切片，分別進行HE及免疫組化染色。所得組織芯片的每個點均經過病理診斷。

1.4 免疫組化染色 采用En Vision二步法進行免疫組化染色，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，0.1mmol/L枸櫞酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復，3%BSA封閉，一抗（MYBL2 工作濃度 1：200；p53 工作濃度 1：100）4℃過夜，DAB顯色，封片后光鏡下觀察。以PBS液代替一抗做陰性對照。

1.5 結果判定 免疫組化染色出現淡黃色至棕黃色顆粒為陽性。MYBL2陽性表達位于細胞質或細胞核，p53定位于細胞核。隨機選取5個以上高倍視野（×400），每個高倍視野計數不少于200個細胞中的陽性細胞數，以細胞質或細胞核出現陽性信號的細胞數＞10%為陽性，＜10%為陰性。

1.6 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。不同組織間MYBL2和p53表達差異采用χ2檢驗，采用Spearman等級相關對胃癌組織中MYBL2和p53的表達行相關性分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MYBL2和p53在胃癌和癌旁組織中表達的比較MYBL2陽性表達為細胞質或細胞核出現黃色至棕黃色顆粒（圖1-2，見插頁），p53蛋白陽性表達為細胞核呈現黃色至棕黃色顆粒（圖3-4，見插頁）。MYBL2和p53在胃癌組織中陽性率分別為62.50%（55/88）、70.45%（62/88），癌旁組織中陽性表達率分別為12.50%（11/88）、10.22%（9/88），胃癌組織中MYBL2和p53表達明顯高于癌旁組織（均P＜0.05）。見表1。

表1 MYBL2和p53在胃癌和癌旁組織中的表達[例（%）]

2.2 MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素的關系隨著胃癌患者臨床分期增加、浸潤深度加深及淋巴結發生癌轉移，胃癌組織中MYBL2和p53表達進一步升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05），而在患者不同年齡、性別、腫瘤大小及分化程度間的表達差異均無統計學意義（均P＞0.05）。見表2。

2.3 胃癌組織中MYBL2表達和p53表達的相關性88例胃癌組織中MYBL2表達陽性和p53表達陽性者51例，MYBL2表達陰性和p53表達陰性者 22例，胃癌組織中MYBL2表達和p53表達呈正相關（r=0.630，P=0.000）。見表 3。

3 討論

MYBL2位于染色體20q13，是Myb轉錄因子家族的高度保守成員，并且在增殖細胞中普遍表達，特別是在胚胎干細胞和成人造血前體[8]。在生理情況下，MYBL2調節細胞周期進展、細胞存活和細胞分化，然而在惡性腫瘤中常常發現表達上調，能夠顯著促進腫瘤的發生和進展[9]。Liang等[10]報道，膽囊癌組織中MYBL2表達增加，且與膽囊癌患者的組織學分級，腫瘤浸潤深度，臨床分期和不良總生存率有關。體外實驗顯示，MYBL2表達的下調可抑制膽囊癌細胞增殖和DNA復制以及裸鼠異種移植腫瘤的生長。相反，MYBL2過表達導致相反的效果。Tao等[11]發現，在乳腺癌細胞中，敲除MYBL2表達能夠恢復上皮標志物E-鈣黏蛋白的表達和細胞-細胞間的鏈接，抑制腫瘤細胞的侵襲、獨立性生長和腫瘤的形成。p53基因位于染色體17pl3，分為野生型和突變型兩種，編碼產物含有393個氨基酸的p53蛋白。野生型p53通過激活和下調基因表達而主要作為轉錄因子起作用，導致細胞周期停滯或細胞凋亡，是一種抑癌基因[12]。突變型p53基因的擴增具有促癌作用，可與野生型p53基因結合抑制其表達，誘導細胞過度增殖、凋亡細胞明顯減少，最終引起惡性腫瘤的發生[13]。

表2 MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素的關系[例（%）]

表3 MYBL2和p53在胃癌組織中表達的相關性

本實驗結果表明，胃癌組織中MYBL2和p53蛋白陽性表達率分別為62.50%、70.45%，癌旁組織中分別為12.50%、10.22%，胃癌組織中MYBL2和p53的表達均明顯高于癌旁組織（P＜0.05）。表明MYBL2和p53表達升高可能與胃黏膜上皮癌變的發生有關，與Yu等[14]在胰腺導管腺癌中的文獻報道一致。結合胃癌患者臨床病理資料進行分析，MYBL2和p53表達與胃癌臨床病理因素關系的結果顯示，隨著胃癌患者臨床分期進展、浸潤深度加深及淋巴結發生癌轉移，MYBL2和p53陽性表達率進一步升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。提示MYBL2和p53表達與胃癌的臨床分期、浸潤深度和淋巴結轉移有關。Spearman相關分析結果顯示，胃癌組織中MYBL2和p53表達共陽性者51例，表達共陰性者22例，胃癌組織中MYBL2和p53陽性表達呈正相關（P＜0.05）。有研究顯示，p53-p21-DREAM途徑抑制MYBL2表達，特別是在細胞應激的條件下，如DNA損傷。然而在p53基因突變的腫瘤中調控細胞周期進程和細胞存活的MYBL2基因異常[15]。表明MYBL2和突變型p53是一對協同作用因素，可能通過某種調節機制參與胃癌的發生、進展過程。

綜上所述，與癌旁組織比較，胃癌組織中MYBL2和p53蛋白存在過表達，其異常表達與胃癌患者的臨床分期、浸潤深度及淋巴結是否轉移密切相關，胃癌組織中MYBL2和p53陽性表達呈正相關。聯合檢測MYBL2和p53有助于評估胃癌的生物學行為和預后，為胃癌的靶向治療和進一步研究其浸潤、轉移的分子機制提供理論基礎。

圖1 MYBL2表達的組織芯片位點圖（En Vision法，×50）

圖2 MYBL2在胃癌組織中陽性表達（En Vision法，×400）

圖3 p53表達的組織芯片位點圖（En Vision法，×50）

圖4 p53在胃癌組織中陽性表達（En Vision法，×400）

4 參考文獻

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