體外模擬SAH狀況下IL-6對大鼠蛛網膜細胞極化狀態的影響

陳功 陳祥 朱丹丹 王自譜 張小潔 信照亮

遲發性腦缺血（DCI）是蛛網膜下腔出血（SAH）最重要的并發癥，與蛛網膜下腔內發生的非特異性炎癥密切相關。研究發現，蛛網膜細胞作為蛛網膜下腔中固有的巨噬細胞，具有抗原提呈能力，能夠參與啟動SAH后的炎癥反應[1-2]。Kai等[3]報道，SAH 時腦脊液（CSF）中凝血酶的水平與出血嚴重程度、SAH病情的發展和腦血管痙攣密切相關。凝血酶已成為實驗性SAH的常用誘導劑。近年來人們逐漸認識到，在不同環境中的巨噬細胞可以發生不同性質的活化，成為具有不同活化表型和功能特征的亞群。蛛網膜細胞具有單核巨噬細胞的類似功能，被認為是蛛網膜下腔中的固有巨噬細胞，能夠參與SAH后蛛網膜下腔中的炎癥反應。因此，研究蛛網膜細胞的極化能力有助于闡明蛛網膜下腔細胞免疫功能低下和SAH后炎癥的發生機制。有研究報道認為，IL-6是SAH后CSF中主要的促炎因子[4]，但IL-6是否可以影響蛛網膜細胞的M1/M2狀態，未見報道。本實驗采用體外培養的大鼠蛛網膜細胞，經外周巨噬細胞極化誘導因子GM-CSF或M-CSF分別刺激后，采用ELISA法檢測極化相關因子IL-6、IL-12p40（M1極化標志性因子）、IL-10（M2極化標志性因子）的變化，觀察是否可以誘導蛛網膜細胞發生極化；然后用凝血酶作為激活劑活化蛛網膜細胞在體外模擬SAH狀況，再采用不同劑量IL-6刺激活化的蛛網膜細胞和正常（非活化）蛛網膜細胞，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法觀察CD68（單核-巨噬細胞標志物）、CK8+18（蛛網膜細胞標志物）、IL-12p40、IL-23（M1 極化標志性因子）、精氨酸酶-1（Arg-I）（M2極化標志性因子）的RNA（相對）表達水平，以研究IL-6對大鼠蛛網膜細胞極化狀態的影響和量效關系。

1 材料和方法

1.1 材料 1~2d的SD大乳鼠（西安交通大學醫學院實驗動物中心提供）40只，體重5~6g。儀器：激光掃描共聚焦顯微鏡，10、200、1 000μl無菌無酶微量吸頭，200μl、1.8ml無菌無酶微量離心管，實時定量PCR儀，紫外分光光度計，普通高速離心機，高速冷凍離心機，低速離心機，漩渦混勻器。試劑：胎牛血清（FBS）、PBS、4%多聚甲醛、0.2%Trition、5%牛血清白蛋白（BSA，西安依科生物有限公司）、DMEM/F12培養基、重組人粒細胞集落刺激因子（GM-CSF）、重組人巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、重組人IL-6、凝血酶、小鼠抗人Cytokeratin8&18（CK8+18）單克隆抗體（英國Abcam公司）、兔抗Vimentin多克隆抗體、兔抗人CD68多克隆抗體（北京博奧森生物有限公司）、羊抗小鼠FITC（英國Abcam公司）、羊抗兔FITC（北京中杉金橋生物科技有限公司）、DAPI細胞染色液（中國碧云天公司）、氯仿、異丙醇、75%乙醇、焦磷酸二乙酯（DEPC）、反轉錄試劑盒、RT-PCR試劑盒。

1.2 大鼠蛛網膜細胞培養 參照蛛網膜細胞培養的方法[1]。將SD大乳鼠乙醇消毒后移入操作臺斷頭處死，用剪刀將頭部皮膚鈍性剝離，再從后囟沿矢狀縫及人字縫剪開顱骨，剝離顱骨后取蛛網膜層，PBS沖洗后剪碎，置于FBS中浸泡5min，移入培養瓶，取0.1~0.2ml完全培養液滴在組織塊表面，置于培養箱12h待組織塊貼壁后，再補加培養液2ml。2~3d換液1次，7~14d后可見細胞鋪滿培養瓶底總面積的70%~80%，即可傳代至12孔板中。用移液器吸取0.1ml細胞懸液，輕輕滴加在蓋玻片上，勿使細胞懸液從蓋玻片溢出。把12孔培養板移至培養箱中。24h后，待大部分細胞貼壁向每孔補加1ml完全培養基。每3d換液1次，當細胞爬滿蓋玻片的50%~60%時取出蓋玻片，立即制片。

1.3 培養蛛網膜細胞的鑒定（ICC檢測） CK8+18和Vimentin作為蛛網膜細胞的標志物已在許多研究得到應用；Vimentin、CD68是組織內和成熟巨噬細胞的標志物。傳代培養蛛網膜細胞，4%多聚甲醛固定30min，PBS沖洗；0.2%Trition作用10min，沖洗；BSA封閉FC段受體，4℃條件下作用90min。再加200μl一抗：包括小鼠抗人CK8+18單克隆抗體，兔抗CD68多克隆抗體，4℃過夜。PBS沖洗3遍，每遍5min后分別向每張玻片加200μl二抗：羊抗小鼠FITC，羊抗兔FITC或Cy3標記山羊抗兔IgG（上海翊圣生物科技有限公司），37℃，45min，PBS沖洗5遍，3min/次，分別向每張玻片加入200μl DAPI作用3min，PBS沖洗，甘油封片。在熒光顯微鏡（日本Nikon公司）下，觀察培養細胞CK8+18、Vimentin、CD68的表達情況，以鑒定蛛網膜細胞。

1.4 SAH狀況下蛛網膜細胞極化狀態的觀察

1.4.1 極化誘導因子GM-CSF和M-CSF對蛛網膜細胞的極化誘導 在體外，人M1和M2均可由CD14單核細胞在不同細胞因子誘導下獲得：在完全培養液中加入重組GM-CSF可獲得M1，而加入M-CSF可獲得M2[5]。待12孔培養板中的蛛網膜細胞爬滿蓋玻片總面積的50%~60%時，棄去細胞上清液，用PBS洗3遍，5min/次，參照Fleetwood等[6]的方法，分別向每孔加入1ml的 GM-CSF（0、500U/ml）、1ml M-CSF（0、100ng/ml）。在刺激后的第6天取出爬片并制片，用ELISA法檢測上清液中IL-6、IL-12p40和IL-10表達水平以觀察其是否可以發生極化。

1.4.2 凝血酶刺激模擬SAH對蛛網膜細胞極化狀態的影響 凝血酶已成為實驗性SAH的常用誘導劑[3]。參照吳碧華等[7]的方法，分別向每孔加入凝血酶（0、10、50U/ml），分別在刺激后的第3天取出爬片并制片作ICC 檢測 IL-1、TNF-α（M1極化標志因子）、CD163、Arg-1（M2極化標志因子）。

1.4.3 IL-6刺激模擬SAH狀況對蛛網膜細胞極化狀態影響 SAH后患者CSF中IL-6水平為100~600pg/ml[8-9]；IL-6水平為270~300pg/ml時與遲發性腦缺血和顱內高壓的發生率相關，而血管痙攣組則高達到450~600pg/ml[8]。因此，筆者選取 100、300、600pg/ml作為低、中、高劑量組。對照組（為正常蛛網膜細胞）和實驗組（為最佳劑量凝血酶刺激3d后的蛛網膜細胞），根據胡曉芳和劉保國等[8-9]所報道的中國成年SAH患者CSF中IL-6水平，分別向每孔加入 IL-6 0、100、300、600pg/ml，分別在刺激后的第1、3、7、14天取出爬片并制片做ICC檢測。

1.4.4 qRT-PCR測定 引物見表1。按實驗設計留取并保存上清液和實驗的細胞。每批實驗分別設置3個復孔。所得數值為3者的均值。

表1 引物表

1.4.4.1 蛛網膜細胞總mRNA提取 每孔加入1ml Trizol，反復吹打，室溫靜置 5min，加入氯仿 200μl，劇烈震蕩，離心后取上層水相，加500μl異丙醇，離心后去上清液，加入1ml 75%乙醇洗滌，離心后棄上清液，干燥后加入50μl DEPC-80℃保存。

1.4.4.2 反轉錄合成cDNA 去除基因組DNA反應后，先加入 8μl的 RNase Free dH2O 和 8μl的 5×PrimeScript Buffer 2，混勻后，再添加2μl RT Primer Mix和2μl的PrimeScript RT Enzyme Mix I，得到 40μl的反應體系，輕輕混勻后，37℃作用 15min，85℃ 作用5s。

1.4.4.3 以cDNA為模板擴增特異基因片段的RT-PCR反應 以 cDNA為模板擴增 CD68、IL-12、IL-23和Arg-I的基因編碼片段，以大鼠β-actin為內參照，條件如下：94℃預變性 30s；95℃變性 5s，60℃退火 30s，40個循環；延伸10min。采用△△CT數學模式對結果進行分析。

1.5 統計學處理 應用Grahpad Prism 5.0或SPSS17.0統計軟件，計量資料用表示，兩組間比較采用Student′s t檢驗，多組間比較采用多組獨立樣本秩和檢驗或方差分析，采用線性相關分析確定其相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠蛛網膜細胞培養及鑒定 體外培養大鼠蛛網膜細胞，細胞呈多角形；ICC可見，95%以上的細胞CK8+18、Vimentin表達陽性，呈絲狀分布于細胞質內，細胞核內未見表達；95%以上的細胞CD68表達陽性，呈絲狀分布于細胞質內，細胞核內未見表達（圖1，見插頁）。

圖1 體外培養大鼠蛛網膜細胞圖（a：倒置顯微鏡，將蛛網膜組織塊接種至培養瓶1～2d，可見組織塊邊緣有細胞游走出來，×100；b：ICC染色，細胞CK8+18表達陽性，×200；c：ICC染色，細胞Vimentin表達陽性，×200；d：免疫熒光染色，細胞CD68表達陽性，×200）

2.2 極化誘導劑GM-CSF和M-CSF對蛛網膜細胞的極化誘導狀況 500U/mlGM-CSF組IL-6和IL-12p40水平顯著性增高，而100U/ml M-CSF刺激組無顯著性變化，見圖2-3；兩組IL-10水平均低于試劑盒檢測下限。可見，在GM-CSF和M-CSF分別刺激下，蛛網膜細胞僅發生了M1型極化而沒有發生M2極化，與外周單核巨噬細胞的反應不同。

圖2 GM-CSF刺激蛛網膜細胞6d后M1極化因子IL-6水平變化

圖3 GM-CSF刺激蛛網膜細胞6d后M1極化因子IL-12p40水平變化

2.3 凝血酶刺激模擬SAH對蛛網膜細胞極化狀態的影響 采用10U/ml及50U/ml凝血酶分別刺激蛛網膜細胞3d后，50U/ml刺激組細胞IL-1、Arg-I和 CD163 mRNA相對表達水平較10U/ml刺激組顯著性升高，TNF-α無明顯變化，見圖4，提示50U/ml凝血酶是較好的刺激濃度。

圖4 凝血酶刺激蛛網膜細胞，IL-1、Arg-I、CD163、TNF-α相對表達水平

2.4 IL-6刺激模擬SAH狀況對蛛網膜細胞極化狀態的影響

2.4.1 對照組 不同濃度的IL-6刺激正常的蛛網膜細胞，經100pg/ml的IL-6刺激后，CD68相對表達量在各時間組間比較無統計學差異（P＞0.05）。其中經300、600pg/ml的IL-6分別刺激后，CD68表達的時間模式，各時間組之間比較差異無統計學意義（P＜0.05）：當IL-6為600pg/ml時，CD68在1d達到最高，在7d最低；當IL-6為300pg/ml時，CD68在3d達到最高，在14d最低（圖5）。蛛網膜細胞的巨噬樣特征呈IL-6刺激劑量大出現和消退早的時間模式。

圖5 不同濃度的IL-6刺激正常蛛網膜細胞CD68表達情況

IL-6刺激正常蛛網膜細胞14d時M1極化因子IL-23和IL-12p40表達水平增高，IL-23表達水平顯著提高，IL-12p40在高劑量時表達最低，刺激劑量為300pg/ml時IL-12p40表達水平最高（圖6）；M2極化因子Arg-Ⅰ表達在14d時增高，且Arg-Ⅰ表達水平隨刺激劑量的增加而降低（圖7），提示，IL-6刺激使得正常蛛網膜細胞發生極化需要很長時間，且不同的極化因子與刺激劑量的關系不同。

圖6 不同濃度的IL-6刺激正常蛛網膜細胞14d后，M1極化因子IL-23和IL-12p40相對表達水平

圖7 不同濃度IL-6刺激正常蛛網膜細胞14d后，Arg-Ⅰ相對表達水平

2.4.2 實驗組 經100pg/ml的IL-6刺激后，CD68相對表達水平在第1天達到最高，第7天最低，各組之間無統計學差異（P＞0.05）；經 600、300pg/ml的 IL-6分別刺激后，從第3天開始，隨著刺激天數的增加，CD68相對表達水平減少，各組之間有差異統計學意義（P＜0.05）（圖 8）。活化的 Ar細胞，經 300~600pg/ml的 IL-6刺激下，根據CD68相對表達水平，1~3d時Ar細胞的巨噬樣特征最為明顯，抗原提呈能力可能增強，而在7~14d，其細胞巨噬樣特征逐漸減弱，抗原提呈能力可能隨之減弱。

圖8 不同濃度IL-6刺激凝血酶活化的蛛網膜細胞CD68相對表達水平

先用50U/ml凝血酶激活蛛網膜細胞3d后加入IL-6刺激。可見在1、3、7、14d蛛網膜細胞M1極化因子IL-23相對表達水平均顯著性增高，在最大刺激量時，3d和7d時增高幅度非常大（圖9）；而M2極化因子Arg-I相對表達水平刺激3d后才顯著性增高，且Arg-Ⅰ表達水平隨刺激劑量的增加而降低（圖10）。SAH狀況下IL-6誘導極化的誘導的時間模式明顯不同；可以早期全程誘導M1極化，而在3d才開始誘導M2型極化。

圖9 不同濃度IL-6刺激凝血酶活化蛛網膜細胞1d、3d、7d和14d，M1極化因子IL-23相對表達水平

3 討論

圖10 不同濃度IL-6刺激凝血酶活化蛛網膜細胞3d后細胞M2極化因子Arg-I相對表達水平

大鼠蛛網膜細胞體外培養技術已日漸成熟，Lam等[10]發現大鼠蛛網膜細胞在結構和功能上均類似于人蛛網膜細胞。Janson等[11]成功誘導了大鼠永生化蛛網膜細胞，加之人蛛網膜細胞培養成功率不高等因素，本研究選擇大鼠蛛網膜細胞作為實驗細胞。許多研究將CK8+18、Vimentin作為蛛網膜細胞的標志物，將CD68作為組織內和成熟巨噬細胞的標志物；因此，我們采用上述標志物鑒定培養的細胞及其活化狀態。

SA為人體防御功能薄弱的區域，體液免疫和細胞免疫功能均明顯底下；靜息狀態下，蛛網膜細胞的漿內線粒體、粗面內質網、高爾基體和溶酶體與外周巨噬細胞相比均不發達，有反應能力低下的結構基礎。在本實驗中，經GM-CSF誘導后，細胞上清液中促炎因子IL-6和IL-12p40水平較未刺激組顯著性增高；而經M-CSF刺激后，細胞上清中促炎因子IL-6和IL-12p40水平與對照組比無統計學意義；目前涉及抗炎因子在SAH中作用的相關報道較少，本實驗中，IL-10水平低于試劑盒檢測下限。提示蛛網膜細胞在GM-CSF的誘導下只發生了M1極化，未發生M2極化，與外周明顯不同；這可能部分解釋了SA中免疫功能低下的原因。Kooijman等[12]發現SAH后的48h，IL-10表達量只有上升趨勢（P＞0.05），而Aihara等[13]發現SAH后14d，IL-10表達量無明顯變化。IL-10在SAH中的作用仍存爭議。Murray等[14]發現發現單核巨噬細胞分泌IL-10部分依賴于MAP激酶級聯JAK-STAT通路和MAP激酶級聯激活通路。是否M-CSF刺激作用未能激活蛛網膜細胞分泌IL-10基因轉錄相關通路，需要進一步研究證明。

Kai等[3]報道，SAH時腦脊液中凝血酶的水平與出血嚴重程度、SAH病情的發展和腦血管痙攣密切相關，凝血酶已成為實驗性SAH的常用誘導劑。凝血酶是一種重要的促炎因子，能上調多種炎癥因子的表達，巨噬細胞表面表達凝血酶受體，可被凝血酶激活[15]。本實驗采用10U/ml及50U/ml凝血酶分別刺激蛛網膜細胞，3d后發現，50U/ml凝血酶刺激組細胞 IL-1、Arg-I和CD163mRNA相對水平較10U/ml凝血酶組顯著性升高；Galea等[16]檢測到SAH患者CSF中CD163水平高于對照組，Fassbender等[17]發現SAH患者CSF中IL-1濃度顯著性增高。故以50U/ml作為活化蛛網膜細胞的最佳濃度。

Schoch等[18]認為CSF中IL-6顯著性增高則SAH患者預后不良，IL-6是CSF中與病情密切相關并能預測SAH預后的標志因子。IL-6主要由單核巨噬細胞產生，作為SAH后SA內主要的促炎因子，能夠使單核細胞發生活化，并促進細胞表達黏附因子及多種炎癥遞質，還可促進內皮細胞釋放第Ⅲ凝血因子，并參與啟動凝血過程[19]。筆者根據SAH后不同階段IL-6在CSF中的濃度[8-9]，選取100pg/ml（低）、300pg/ml（中）和600pg/ml（高）劑量組；分別刺激正常蛛網膜細胞和經凝血酶刺激活化的蛛網膜細胞1、3、7、14d，發現IL-6的劑量影響CD68的表達，且對正常和活化蛛網膜細胞刺激結果一致。中高劑量IL-6刺激時蛛網膜細胞的巨噬樣特征在1～3d最為明顯，7～14d逐漸減弱。

經3種劑量的IL-6分別刺激正常蛛網膜細胞，1、3、7d后IL-23相對表達水平與未加入IL-6刺激組相比無統計學差異，而14d刺激組IL-23水平較未加入IL-6刺激組顯著性升高，且隨刺激劑量的增加而增加。刺激經凝血酶活化的蛛網膜細胞，1、3、7、14d，IL-23 表達水平均較未加入IL-6刺激組相比顯著性升高。提示蛛網膜細胞（凝血酶刺激）的活化狀態與發生M1極化改變密切相關；還發現，當高劑量IL-6刺激活化的蛛網膜細胞3～7d，IL-23表達水平達到最高。Schoch和Xie等[18，20]發現，SAH 發生 4~6d后，血性 CSF中 M1相關因子IL-6、TNF-α和IL-1β水平顯著性高于對照組。在臨床上，DCI多發生于SAH后的1～3d，7～14d是發病的高峰時間。提示，在IL-6可以很快誘導凝血酶活化蛛網膜細胞發生M1極化，且其時間模式與臨床上發生DCI的時間模式基本一致。

Arg-I是免疫系統中的關鍵組分，由Th2細胞因子如IL-4、IL-10和IL-13誘導產生。王青山等[21]發現IL-6能在一定程度上抑制巨噬細胞由M1型向M2型轉化。Kigerl等[22]發現小鼠脊髓損傷后 3～7d，Arg-I表達陽性的M2細胞增高。本實驗發現IL-6刺激正常蛛網膜細胞，1、3、7、14d Arg-I相對表達水平與未加入 IL-6 刺激組相比均有升高，而刺激活化的蛛網膜細胞僅在第3天時Arg-I相對表達量與未加入IL-6刺激組相比有升高。Kroner等[23]也發現，脊髓損傷后1~15d內主要以M1為主，Arg-I表達陽性的M2細胞數僅在第4天達到高峰，提示IL-6可刺激正常蛛網膜細胞可發生M2極化改變。同時還發現，100pg/ml的IL-6刺激活化的蛛網膜細胞后Arg-I相對表達水平最高，故推測在低劑量促炎因子的作用下，細胞M2極化特征更為明顯。在CSF中，iNOS與Arg競爭性消耗精氨酸，Yatsushige等[24]發現，SAH后CSF中iNOS表達增加，過高水平的NO則對細胞的代謝和生存不利。提示增加CSF中Arg-I的量以減少NO的產生，利用精氨酸Arg-I代謝途徑以緩解SAH后并發癥的發生可能是一個思路。

總之，蛛網膜細胞在GM-CSF的誘導下只發生了M1極化，未發生M2化，與外周明顯不同。在SAH后的CSF微環境中，蛛網膜細胞經IL-6刺激后發生M1/M2極化的時間和表現模式多樣，也與外周不同，與臨床上變化多端的情況吻合。雖然單純描述蛛網膜細胞的M1/M2極化狀態改變，簡化了SAH后SA內巨噬細胞相關的炎癥反應，但是本研究還是為SAH后蛛網膜細胞極化改變提供了一個新的基本概念。

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