染料木素甲氧基封端的聚乙二醇-乳酸羥基乙酸共聚物膠束在小鼠體內的組織分布研究Δ

何禮，金虹，韓瑞偉，閻雪瑩（.四川中醫藥高等專科學校藥學院，四川綿陽62000；2.黑龍江中醫藥大學藥學院，哈爾濱 50040）

染料木素（Genstein）又稱5，7，4-三羥基異黃酮、染料木黃酮、金雀異黃素，是從葛根、槐花、染料木和廣豆根等豆科植物中提取得到的一種異黃酮類活性成分。大量研究證實，染料木素具有雌激素作用、抗氧化作用及清除自由基、抑制蛋白酪氨酸激酶活性、誘發細胞程序性凋亡、抑制血管生成等作用[1-4]。目前國內用于治療骨質疏松的一類新藥染料木素膠囊已獲準進入臨床Ⅱ期試驗，美國國立癌癥研究中心將其作為腫瘤預防劑進行臨床研究[5-6]。然而染料木素在生物藥劑學中屬于生物藥劑學分類系統（BCS）中的Ⅱ類化合物，在水中溶解度僅為0.13 μg/mL[7]，且存在較強的首關效應，直接口服后在體內生物利用度低，極大地限制了其臨床應用。

在聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）納米的改性研究中應用最多的是聚乙二醇（PEG）的衍生物，PLGA和PEG均已被美國FDA批準用于藥物輸送系統，將疏水性的PLGA和親水性的甲氧基封端的聚乙二醇（MePEG）嵌合在一起合成的高分子嵌段聚合物甲氧基封端的聚乙二醇-乳酸羥基乙酸（MePEG-PLGA）對難溶性藥物具有增溶效果，其抗血液稀釋能力突出，是一種緩釋、高效且安全的長循環納米藥物載體。本研究組為了提高染料木素溶解度和生物利用度，以MePEG-PLGA為載體成功制備了染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束的凍干制劑[8-10]。本文在此基礎上，通過尾靜脈注射染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束，采用高效液相色譜法測定給藥后不同時間小鼠血漿及各組織（心、肝、脾、肺、腎）中染料木素的濃度，考察染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束在小鼠體內的分布特性，為其進一步研究開發和臨床應用提供參考依據。染料木素的化學結構式見圖1。

圖1 染料木素的化學結構式Fig 1 Chemical structures of genistein

1 材料

1.1 儀器

LC-2010 AHT型高效液相色譜儀（日本島津公司）；R-205B型旋轉蒸發器和W202B型數控恒溫浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）；Scientz-ⅡD型超聲波細胞破碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；QL-901型旋渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）。

1.2 藥品與試劑

染料木素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111704-200501，純度：≥98%）；染料木素原料藥（西安小草植物科技有限責任公司，批號：XC100310，純度：≥98%）；MePEG-PLGA[濟南岱罡生物科技有限公司，批號：102106，MePEG 相對分子質量為 4 000，MePEGPLGA（1∶3，m/m），丙交酯-乙交酯（75∶25，m/m）]；高純度大豆卵磷脂（德國德固賽公司，批號：120404）；注射用大豆油（鐵嶺北亞注射用油有限公司，批號：20111206）；肝素鈉注射液（批號：1710071-C172，規格：2 mL∶1.25萬u）和醫用甘油（批號：2014-1164）均購自北京奧博星生物技術有限責任公司；泊洛沙姆188和泊洛沙姆407（上海協泰化工有限公司，批號：2864-12、1065-35）；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動物

昆明種小鼠，♀♂各半，體質量（20±2）g，黑龍江中醫藥大學藥物非臨床研究實驗室提供，實驗動物生產合格證號：SCXK（黑）2016-0004。

2 方法與結果

2.1 膠束和乳劑的制備

2.1.1 染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束 分別稱取21 mg染料木素原料藥，110 mg MePEG-PLGA置于錐形瓶中，加入丙酮-乙醇（3∶2，V/V）的混合有機溶劑10mL，50℃水浴使其完全溶解。在500 r/min的機械攪拌條件下，將所得混合溶液以3滴/s的速度滴入預先配好的20 mL含1%泊洛沙姆188的水溶液中，滴定結束后繼續攪拌10 min，將所得產物在40℃下減壓除去有機溶劑，經0.45 μm微孔濾膜過濾，加3%海藻糖作為凍干保護劑，混勻，凍干后保存。

2.1.2 染料木素乳劑的制備 精密稱取高純度大豆卵磷脂0.60 g、注射用大豆油5 g，置于燒杯中，60℃左右恒溫攪拌約10 min，加入染料木素原料藥50 mg，加熱攪拌使溫度達到70℃并保持恒定，得油相。精密稱取醫用甘油1.25 g、泊洛沙姆407 1.00 g，置于燒杯中，加入45mL注射用水，加熱攪拌使之澄清，繼續加熱攪拌使溫度達到70℃并保持恒定，得水相。在70℃恒定溫度下，將油相緩慢加入到水相中并不斷攪拌，加完后繼續攪拌10 min，制得初乳。初乳用超聲波細胞粉碎機冰水浴探頭超聲15 min（超聲2 s，間歇2 s，功率：750 W），制得染料木素乳劑。

2.2 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL。

2.3 血漿和組織樣品處理

2.3.1 血漿樣品處理 精密吸取100 μL血漿樣品，置于1.5 mL離心管中，加入400 μL甲醇沉淀血漿蛋白，渦旋混合1 min，10 000 r/min（離心半徑9.5 cm）離心10 min，吸取全部上清液過0.22μm微孔濾膜，按“2.2”項下色譜條件進樣分析。

2.3.2 組織樣品處理 取小鼠完整心、肝、脾、肺、腎組織后，用生理鹽水洗凈組織表面殘血，濾紙吸干，精密稱定組織樣品質量后置于手動組織勻漿器中，按質量比為1∶2加入生理鹽水，手動勻漿。精密移取100 μL小鼠各組織（心、肝、脾、肺、腎）勻漿液，置于1.5 mL離心管中，加入400 μL甲醇沉淀組織勻漿液中血漿蛋白，渦旋混合1 min，10 000 r/min（離心半徑9.5 cm）離心10 min，吸取全部上清液過0.22μm微孔濾膜，按“2.2”項下色譜條件進樣分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性考察 取小鼠空白血漿、空白血漿+0.2μg/mL染料木素對照品溶液、靜脈注射藥物后90 min的小鼠血漿樣品，按“2.3”項下方法進行處理后，再按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。結果，染料木素的保留時間為10.6 min，基線噪音較小，血漿中代謝物峰及其他內源性物質均不干擾染料木素的測定。同法考察心、肝、脾、肺、腎組織中染料木素的專屬性，結果均表明各組織中其他內源性物質不干擾染料木素的測定（圖略），說明本方法具有較高的專屬性。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram

2.4.2 線性關系考察 精密吸取小鼠空白血漿和各組織（心、肝、脾、肺、腎）勻漿液各100 μL，依次加入不同質量濃度的染料木素對照品溶液200 μL，使血漿和各組織勻漿液中所含染料木素的質量濃度相當于0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μg/mL，按“2.3”項下方法進行處理后，再按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以樣品中染料木素的質量濃度為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），進行回歸分析，求得線性回歸方程。結果表明，血漿和各組織中染料木素檢測質量濃度的線性范圍均為0.1～12.8 μg/mL。血漿和各組織中染料木素的線性關系考察結果見表1。

表1 血漿和各組織中染料木素的線性關系考察結果Tab 1 Linear range of genistein in plasma and each tissues

2.4.3 檢測限與定量下限考察 按2015年版《中國藥典》（二部）[11]中關于檢測限與定量下限的要求，將染料木素自線性范圍的最低質量濃度0.1 μg/mL向下逐級稀釋，按“2.2”項下色譜條件進樣分析。結果顯示，信噪比為3時染料木素的檢測限為0.03 μg/mL，信噪比為10時染料木素的定量下限為0.1 μg/mL。

2.4.4 精密度試驗 分別精密吸取小鼠空白血漿和各組織（心、肝、脾、肺、腎）勻漿液100 μL，分別加入不同質量濃度的染料木素對照品溶液200 μL，制成染料木素質量濃度分別為0.2、1.6、10 μg/mL的樣品溶液，按“2.3”項下方法進行處理后，再按“2.2”項下色譜條件進樣分析。每份樣品連續進樣5次，根據回歸方程計算染料木素的濃度，考察日內精密度；連續進樣5 d考察日間精密度，結果見表2。

2.4.5 準確度試驗和提取回收率試驗 精密吸取小鼠空白血漿和各組織（心、肝、脾、肺、腎）勻漿液各50 μL，分別加入不同質量濃度的染料木素對照品溶液200 μL，制備成染料木素質量濃度分別為0.2、1.6、10 μg/mL的樣品溶液，按“2.3”項下方法進行處理后，再按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，每個濃度5個樣品。另取質量濃度為0.2、1.6、10 μg/mL的染料木素對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，每個濃度5個樣品。以樣品溶液測得量與加入量的比值計算準確度，以樣品溶液中染料木素峰面積與相應濃度對照品溶液中染料木素峰面積之比計算提取回收率，結果見表3。

表2 精密度試驗結果（n＝5）Tab 2Results of precision tests（n＝5）

表3 準確度和提取回收率試驗結果（n＝5）Tab 3 Results of recovery and extraction recovery test（n＝5）

2.4.6 穩定性試驗 按“2.4.4”項下方法操作制備染料木素質量濃度分別為0.2、1.6、10 μg/mL的樣品溶液，各3份，考察其凍融穩定性及室溫穩定性。考察凍融穩定性時，將3種質量濃度的樣品溶液置于－20℃環境冰凍，然后取出，室溫融化，反復2次，每次凍融時間間隔24 h，第2次室溫融化后按“2.3”項下方法進行處理，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定。考察室溫穩定性時，將3種質量濃度的樣品溶液在室溫下放置8 h后，按“2.3”項下方法進行處理，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定。結果，3種質量濃度的樣品溶液中染料木素濃度的RSD均小于10%（n＝3），表明樣品溶液在反復凍融2次和室溫放置8 h內的穩定性均符合相關要求。

2.5 染料木素膠束在小鼠體內的組織分布

取小鼠48只，隨機分為乳劑組和膠束組，每組24只，試驗前12 h禁食，不禁水，按40 mg/kg（按預實驗及相關文獻[12]確定）的劑量尾靜脈注射染料木素乳劑或染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束。分別于給藥后5、30、90 min時間點（按預實驗確定）各取8只小鼠，摘眼球取血0.5 mL置于肝素化離心管中，再斷頸處死后立即解剖，取出小鼠完整心、肝、脾、肺、腎，用生理鹽水洗凈組織表面殘血，濾紙吸干后精密稱質量，按“2.3”項下方法進行處理后，再按“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積，代入相應回歸方程計算不同時間點小鼠血漿和各組織中染料木素的濃度。兩組小鼠給藥后不同時間點血漿和各組織中染料木素的濃度分布見圖3。

圖3 兩組小鼠給藥后不同時間點血漿和各組織中染料木素的濃度（n＝8）Fig 3 Content of genistein in plasma and each tissues of mice in 2 groups at different time points（n＝8）

由圖3可以看出，膠束組小鼠給藥后5、30、90 min血漿中染料木素的濃度均高于乳劑組，給藥后5、30 min肝組織中染料木素的含量均低于乳劑組，至于90 min肝組織中染料木素的含量均高于乳劑組，可能是因為膠束在90 min左右突然釋放了藥物所致，其體原因有待后續深入研究。提示染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束可提高染料木素在血液中的濃度，有助于提高染料木素的治療效果；注射后30 min內肝中染料木素的濃度較低，有利于降低染料木素的肝毒性。

采用3P97模型嵌合通用程序進行擬合，計算兩組小鼠血漿及各組織中染料木素的AUC0-90min和平均駐留時間（MRT），采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，結果以±s表示，采用t檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。兩組小鼠血漿和各組織中染料木素的AUC0-90min和MRT結果見表4。

表4 兩組小鼠血漿和各組織中染料木素的AUC0-90 min和MRT結果（±s，n＝8）Tab 4 AUC0-90 minand MRT of genistein in plasma and each tissues of mice in 2 groups（±s，n＝8）

表4 兩組小鼠血漿和各組織中染料木素的AUC0-90 min和MRT結果（±s，n＝8）Tab 4 AUC0-90 minand MRT of genistein in plasma and each tissues of mice in 2 groups（±s，n＝8）

注：與乳劑組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Note：vs.emulsion group，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

膠束組40.32±1.03＊＊14.36±0.06 10.51±0.02＊9.79±0.01 13.79±0.04 19.38±0.25樣品血漿心肝脾肺腎AUC0-90 min，μg·min/g乳劑組914.54±12.76 1 088.46±24.68 1 923.49±31.49 1 635.07±10.15 1 108.46±9.37 1 096.83±6.44膠束組2 264.98±14.05＊＊858.54±2.07 1 312.06±11.78＊1 826.79±21.57 1 288.63±8.79 1 676.88±6.33＊MRT，min乳劑組19.77±0.14 16.45±0.28 17.07±0.11 9.01±0.08 12.14±0.15 16.44±0.16

由表4結果可以看出，與染料木素乳劑比較，染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束可顯著增加染料木素在血漿中的AUC0-90min，顯著延長其MRT；可顯著減少染料木素在肝組織中的AUC0-90min，顯著縮短其MRT（P＜0.05）。

3 討論

血液樣品含有大量的蛋白質，直接進樣會使色譜柱阻塞，柱壓升高，因此需要進行適當的前處理去除蛋白。目前常用的方法有蛋白沉淀法（PPT）、液-液萃取法（LLE）、固相萃取法（SPE）等。筆者首先嘗試使用甲醇和乙腈作為沉淀試劑的PPT法，發現使用甲醇作為沉淀劑可得到較好效果，并且PPT法簡單易行，因此選擇甲醇作為沉淀劑去除蛋白質。由于國內外現尚無染料木素注射制劑上市，且染料木素在水中幾乎不溶，無法直接溶解在生理鹽水中進行大鼠的尾靜脈注射，根據參比制劑選擇原則，實驗中將染料木素制成乳劑作為參比制劑與染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束進行比較。

普通納米載藥系統靜脈注射進入體內后易被單核巨噬系統（MPS）中的巨噬細胞快速識別并吞噬，肝和脾是MPS豐盈的器官，因而普通納米制劑大多天然靶向這些器官，而對治療非MPS部位組織器官疾病療效則顯著降低。聚合物膠束是一種由兩親嵌段共聚物在適當條件下自發形成的核-殼納米載體，其中疏水嵌段構成內核，親水嵌段形成外殼，這樣的膠束結構不僅可以很好地分散在水介質中，而且其內核可為脂溶性的藥物提供疏水微環境，因此將染料木素制備為膠束可有效改善其溶解度。同時膠束具有長循環性，其親水性和柔韌性外殼與納米級的粒徑能夠有效減少與免疫球蛋白的作用，防止微粒聚集，可大大降低膠束被識別并被吞噬的機會，提高其在非MPS中的分布，延長載藥系統在血液循環中的滯留時間，有效提高其生物利用度。

染料木素MePEG-PLGA共聚物膠束增加了藥物在血漿中的蓄積量而降低了在肝中的蓄積量，其原因可能在于MePEG-PLGA共聚物膠束的親水外殼可以使膠束體系在一定程度上避免某些器官網狀內皮系統的識別和攝取。本研究有望為染料木素的臨床應用提供一種療效更佳、更安全的新制劑。

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