UPLC-MS/QAMS測定小鼠血漿中石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的濃度Δ

魯艷柳，黃思，劉浩，曾瑤，王建秋，徐亞沙，陸遠富，何芋岐（遵義醫學院基礎藥理教育部重點實驗室/特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，貴州遵義 563003）

金釵石斛（Dendrobium nobileLindl.）為蘭科石斛屬（DendrodiumSW.）植物，是《中國藥典》明確規定的藥用石斛的植物來源，又名扁金釵、扁黃草、扁草、黃草等[1]。《神農本草經》中將其列為上品，素有“千金草”之稱[2]，具有滋陰清熱、益胃生津、潤肺止咳、明目強身等功效[1]。現代藥理學研究表明，金釵石斛總生物堿是金釵石斛的主要活性成分，具有止痛、解熱作用，可以降低心率、血壓，減慢呼吸，并且緩解巴比妥引起的中毒癥狀[3]，還具有降血糖[4]、抗白內障[5]、抗腫瘤[6]、減少細胞凋亡[7]、抗氧化[8]和抗老年癡呆[9]等作用。而石斛堿（Dendrobine）是金釵石斛總生物堿中最主要的特征性成分[1，3]，開發應用前景廣闊。本課題組前期鑒定出石斛堿在人肝微粒體中的主要代謝產物有M-250、M-280[10]，本文在此基礎上，采用超高效液相色譜-質譜/一測多評法（UPLC-MS/QAMS），首次建立了測定小鼠血漿中石斛堿及其代謝產物M-250、M-280濃度的方法，為進一步研究石斛堿的藥動學提供了實驗依據。石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的結構圖見圖1。

圖1 石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的結構圖Fig 1 Structures diagrams of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

1 材料

1.1 儀器

Thermo Scientific Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨MS系統和Thermo Ultrmate 3000 UPLC系統（美國Thermo Fisher公司）；Genius 1022液氮發生器（英國Peak公司）；Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）；XS205電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；XW-80A漩渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；Microfuge 20R高速離心機（美國Beckman Coulter有限公司）。

1.2 藥品與試劑

石斛堿對照品（北京華邁科生物技術有限責任公司，批號：D990100，純度：≥99.0%）；鹽酸偽麻黃堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：171237-201208，純度：≥99.9%）；乙腈、甲醇、甲酸均為質譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康SPF級C57BL/6J小鼠24只，♂，體質量18～22 g，由重慶第三軍醫大實驗動物中心提供，實驗動物生產合格證號：SCXK（渝）2012-0005，飼養溫度 21～22℃，濕度56%～65%，明暗交替時間12/12 h。本實驗符合遵義醫學院實驗動物倫理委員會的倫理學標準。

2 方法與結果

2.1 分組與給藥

將小鼠隨機分為空白對照組和給藥組，每組12只，實驗前禁食12 h，自由飲水。根據本課題組前期試驗結果，給藥組小鼠按60 mg/kg灌胃石斛堿[以0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液助懸]，空白對照組小鼠灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液，1 h后，眼眶取血0.2 mL至肝素化的離心管中，1 856×g離心15 min，分離血漿待測。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取石斛堿對照品15.52 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度，混勻，即得對照品貯備液，于4℃保存，備用。使用前以乙腈稀釋，得到含石斛堿質量濃度分別為51.73、15.52、7.76、1.55、0.78、0.16μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 內標溶液 精密稱取鹽酸偽麻黃堿對照品10.01mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解至刻度線，混勻，即得內標貯備液，于4℃保存，備用。使用前以乙腈稀釋，得到含鹽酸偽麻黃堿質量濃度為0.4μg/mL的內標溶液。

2.3 標準血漿樣品的制備

分別取100μL空白血漿，加入不同質量濃度的石斛堿對照品溶液20μL，渦旋30 s，再依次加入內標溶液20μL和乙腈200 μL，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液，即得含石斛堿質量濃度分別為912.94、456.47、91.29、45.65、9.13、3.04、0.91 ng/mL的標準血漿樣品。其中，質量濃度為912.94、91.29、9.13 ng/mL的標準血漿樣品為高、中、低質量濃度的質控血漿樣品，均平行制備5份。

2.4 血漿樣品的處理

取100μL血漿樣品，加入乙腈20μL，渦旋30 s，再依次加入內標溶液20μL和乙腈200μL，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液50 μL，進樣分析。

2.5 色譜條件與質譜條件

2.5.1色譜條件色譜柱：Hypersil Gold C18（150 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～0.5 min，5%B；0.5～15 min，5%→95%B；15～17 min，95%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.5.2 MS條件 采用可加熱電噴霧離子源（HESI）的離子化方式；霧化溫度：300℃；離子傳輸管溫度：350℃；鞘氣流速：35 arb；輔助氣流速：15 arb；噴霧電壓：3.5 kV；碰撞電壓：30、40、50 eV；質荷比（m/z）檢測范圍：100～1 500；掃描模式：全掃描/正離子模式；全掃描模式下分辨率：70 000 FWHM。

2.6 專屬性考察

取100μL空白血漿，加入200μL乙腈，渦旋30 s，15 493×g離心10 min，取上清液即得空白血漿樣品。取空白血漿樣品、標準血漿樣品和按“2.4”項下方法處理得到的血漿樣品，按“2.5”項下方法進樣測定。結果顯示，石斛堿（[M+H]+m/z264.195 9）及其代謝產物M-250（[M+H]+m/z250.180 1）、M-280（[M+H]+m/z280.190 6）的保留時間分別為7.76、7.73、8.11 min，空白血漿中的內源性物質不干擾石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的測定。石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的選擇離子圖見圖2。

2.7 線性關系、定量下限和檢測限考察

取“2.3”項下對應樣品進樣測定后，采用加權（1/X2）最小二乘法，以石斛堿與內標的峰面積之比為縱坐標（y），石斛堿質量濃度為橫坐標（x）進行回歸分析，得回歸方程為y＝－10－5x2+0.043 2x+0.430 9（r＝0.999 6）。結果表明，石斛堿檢測質量濃度的線性范圍為9.13～912.94 ng/mL，定量下限為3.04 ng/mL，檢測限為0.91ng/mL。

2.8 基質效應考察

取“2.3”項下高、中、低質量濃度的質控血漿樣品，進樣測定，記錄石斛堿和內標峰面積，分別記為A1和B1。將空白血漿換為水，同法制備高、中、低質量濃度的石斛堿+內標溶液，均平行制備5份，進樣測定，記錄石斛堿和內標峰面積，分別記為A2和B2。按A1/A2×100%計算石斛堿的基質效應，B1/B2×100%計算內標的基質效應，結果見表1。

表1 基質效應考察結果（n＝5）Tab 1Results of matrix effect（n＝5）

2.9 精密度和準確度考察

取“2.3”項下高、中、低質量濃度的質控血漿樣品，分別連續進樣測定5次，計算日內精密度和準確度，連續測定3 d，計算日間精密度和準確度，結果見表2。

2.10 穩定性試驗

取“2.3”項下高、中、低質量濃度的質控血漿樣品，分別考察15℃保存24 h，－70℃保存并反復凍融3次，以及－70℃保存15 d后樣品的穩定性，結果見表3。

圖2 石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的選擇離子圖Fig 2 Selected ion chromatogram of dendrobine and its metabolites M-250 and M-280

2.11 血漿樣品中石斛堿的濃度

按“2.4”項下方法處理給藥組小鼠的血漿樣品，按“2.5”項下方法進樣測定，計算血漿樣品中石斛堿的質量濃度為（41.3±5.7）ng/mL（n＝12）。

表2 精密度和準確度考察結果Tab 2 Results of precision and accuracy tests

表3 穩定性考察結果（n＝3）Tab 3Results of stability tests（n＝3）

2.12 一測多評法計算血漿樣品中石斛堿代謝產物M-250、M-280的濃度

按一測多評法，取“2.11”項下給藥組小鼠的血漿樣品，以石斛堿對照品為對照，按“2.5”項下條件進樣測定，按Wk＝fs/k×[（Ws×Ak）/As]計算其代謝產物 M-250、M-280的濃度。式中，Wk為待測物質量濃度；fs/k為相對校正因子，此處為1.0；Ws為石斛堿對照品質量濃度；As為石斛堿對照品峰面積；Ak為待測物峰面積。結果顯示，血漿樣品中石斛堿代謝產物M-250、M-280的質量濃度分別為（493.0±73.1）、（41.4±3.0）ng/mL（n＝12）。

3 討論

在本課題組前期研究中，通過精確相對分子質量和二級碎片離子信息，鑒定了石斛堿在人肝微粒體中Ⅰ相代謝的4個主要代謝產物M-250、M-262、M-280和M-296，以及Ⅱ相代謝的1個主要代謝產物M-440[10]。本文檢測了小鼠灌胃石斛堿后，血漿中石斛堿及其主要代謝產物M-250、M-280的濃度。但獲得石斛堿代謝產物的標準品，以及對其進行準確定量還存在比較大的困難。因此，本研究借鑒了天然藥物質量評價中的一測多評法，以其進行兩種主要代謝產物M-250、M-280的定量研究。

一測多評法對于對照品難以得到的多指標測定有其特殊的優勢[11]，目前在天然藥物及其制劑的質量評價中應用已較成熟，如《美國藥典》34版中有25個天然藥物及制劑、《歐洲藥典》7.0版中有9個天然藥物、2015年版《中國藥典》（一部）中黃連及銀杏葉提取物等的質量評價均采用該方法[12]。在多指標檢測中，以某一組分的對照品為對照，建立與其他待測組分之間的fs/k（即RCF），計算其他組分的含量，公式為：fs/k＝（Wk×As）/（Ws×Ak）。式中，Wk為待測物質量濃度；As為對照品峰面積；Ws為對照品質量濃度；Ak為待測物峰面積。

結構類型相同的化合物，RCF的值往往接近1，如2015年版《中國藥典》（一部）中黃連藥材各生物堿的RCF值均為1.0，可直接以鹽酸小檗堿對照品的峰面積為對照，分別計算小檗堿、表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的含量。考慮到石斛堿代謝產物M-250、M-280的結構與石斛堿十分相似，如圖1，故暫定這兩個代謝產物的RCF值均為1.0，并以峰面積相當的石斛堿對照品質量濃度進行計算。但上述推測還需要進一步的試驗證實。

綜上所述，本研究建立了一種靈敏、準確，可用于小鼠血漿中石斛堿及其代謝產物M-250、M-280的濃度測定的方法，為研究石斛堿的藥動學奠定了基礎。

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