SMAD4低表達促進人血管平滑肌細胞遷移和凋亡

殷佩， 王穎， 沈振亞

(蘇州大學附屬第一醫院心臟大血管外科， 江蘇 蘇州 215006)

目前我國胸主動脈瘤與夾層的發病率呈顯著上升趨勢，且患者多以急性發病住院，死亡率極高。該病發病是一個多因素過程，主要病理特征是炎性細胞浸潤、中層平滑肌細胞壞死、細胞外基質降解、纖維化、彈力纖維變脆等[1]。血管重構是管壁成分在血管活性物質和血流剪切力變化的刺激下,為適應和修復損傷發生的改變，包括血管內皮細胞增殖、平滑肌細胞凋亡、平滑肌細胞和巨噬細胞遷移等過程,其在胸主動脈瘤/夾層的疾病轉歸中發揮了重要作用。目前對主動脈瘤/夾層發生的調控機制及其預后影響因素仍不清楚，部分研究提示胸主動脈瘤與TGF-β信號通路的活化具有較強的關聯[2]。因此研究其關鍵分子SMAD4對平滑肌細胞遷移和凋亡的影響，可深入揭示以血管功能與結構病理改變為基礎的疾病機制，可為精準臨床路徑的制定提供參考。

SMAD4是TGF-β信號通路的關鍵因子，是參與信號轉導調控的關鍵組分。許多研究顯示，TGF-β是具有多重生理作用的轉化生長因子，與細胞運動遷移、炎癥反應和細胞凋亡密切相關，并參與主動脈瘤等很多疾病的發生發展進程[3-5]。而SMAD4的表達抑制與TGF-β信號系統的活化相關，有報道表明SMAD4敲除的小鼠主動脈瘤發病率遠高于對照組[6]。本實驗以SMAD4為切入點，觀察TGF-β信號傳導變化對體外培養的人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cell,HASMC)遷移及凋亡的調控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

HASMC為蘇州大學心血管病研究所實驗室保存。DMEM培養基、胎牛血清以及不含EDTA的0.25%胰蛋白酶(美國Gibco公司)，Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)，細胞凋亡檢測試劑盒(美國BD公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，Hoechest33258染色液(碧云天生物技術公司)，siRNA-SMAD4、陰性對照siRNA(si-RNA-NC,GenePharma公司合成)，青霉素(100 U/mL)-鏈霉素(100 mg/mL)為美國Hyclone公司產品。高速離心機(美國Thermo公司)，相差顯微鏡(日本Nikon公司)，CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，流式細胞儀及其分析系統(美國BD公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)，ChemiDoc XRS+化學發光成像系統(美國Bio-Rad公司)。

1.2 HASMC培養及轉染

將處于對數生長期的HASMC接種于3個6孔細胞培養板，用于轉染，細胞培養基中不加抗生素。細胞接種后分3組：siRNA-SMAD4組、siRNA-NC組(陰性對照)和空白組。空白組的HASMC不作任何處理。細胞轉染6 h后更換含有10%FBS及青-鏈霉素的完全培養基。

1.3 流式細胞術檢測各組HASMC凋亡率

在上述各組HASMC細胞中加入血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)進行誘導凋亡處理，終濃度為10-6mol/L。24 h后，用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室溫下以2 000 r/min離心5 min，用預冷PBS(4 ℃)洗滌各組細胞，加入300 μL稀釋的結合緩沖液重懸細胞；取100 μL細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻后避光，室溫孵育15 min，加400 μL的PBS，使用流式細胞儀分析細胞凋亡率。以上各組均為3個復孔，結果為3個復孔的均值。

1.4 Transwell檢測HASMC的遷移能力

在Transwell小室的8 μm聚碳酸酯膜上加入200 μL含有2%FBS的DMEM，于37 ℃培養箱中孵育1 h，使膜層水化，吸棄培養基，將制備的細胞懸液(1.5×104個細胞/mL)以200 μL/孔接種于24孔板，培養24 h。消化各組細胞后，使用細胞計數板計數并使用DMEM進行重懸。每孔上室加入200 μL單細胞混懸液(1.5×104個細胞/mL)，加入AngⅡ至終濃度為10-6mol/L；下室加入500 μL含有10%FBS的DMEM。放入37 ℃培養箱中繼續孵育。8 h后用棉簽拭去小室上層膜上未遷移的細胞，膜下方的細胞即為遷移細胞，用Hoechest33258染色10 min，并于倒置熒光顯微鏡下拍照，Image J軟件分析遷移細胞數。鏡下隨機選10個視野拍照并計數，結果以均數±標準差表示。

1.5 蛋白質印跡法檢測各組細胞中凋亡因子的表達

將10×的RIPA溶液稀釋成1×，加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使其終濃度為1 mmol/L，收集細胞，吸盡細胞培養液，PBS洗滌去除血清等，去除PBS；加入100 μL裂解液，冰上裂解10 min后，將細胞轉移至1.5 mL的離心管(離心管提前預冷)，超聲10 s，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液即為提取的蛋白樣品。利用BCA法測定蛋白濃度，蛋白濃度調平，加入1/3體積4×上樣緩沖液，95 ℃水浴5 min，分裝后于-80 ℃保存備用。取20 μL蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，并轉移至PVDF膜。一抗分別為Cleaved Caspase-3及Bcl-2(1 ∶1 000)，二抗分別為山羊抗小鼠和山羊抗兔抗體(1 ∶5 000)。洗滌3次后，在PVDF膜上滴加ECL顯影劑，然后放入ChemiDoc XRS+成像系統中進行成像。

1.6 統計分析

2 結果

2.1 SMAD4低表達促進HASMCs凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，與陰性對照siRNA-NC組比較，轉染siRNA-SMAD4后HASMC早期細胞凋亡比例和晚期細胞凋亡比例均明顯升高(P均<0.05)。見圖1。上述結果說明SMAD4低表達可明顯促進平滑肌細胞凋亡。

n=3

2.2 SMAD4低表達增強HASMC遷移能力

Transwell檢測結果顯示，空白組平均每視野遷移細胞數為19±6，siRNA-NC組平均為25±7，siRNA-SMAD4組平均為114±21。與空白組和siRNA-NC組相比，轉染siRNA-SMAD4后HASMC遷移細胞數顯著增多(P均<0.01)。見圖2。該結果說明SMAD4低表達能顯著促進HASMC的遷移。

2.3 SMAD4低表達引起凋亡相關蛋白Cleaved Caspase-3表達上調

蛋白質印跡結果顯示，SMAD4基因低表達可明顯下調Bcl-2的表達，顯著上調Cleaved Caspase-3的表達(P均<0.05)。見圖3。

圖2 Transwell檢測各組主動脈平滑肌細胞的遷移數

圖3 各組Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達量

3 討論

胸主動脈瘤及夾層是一類致死率極高的復雜疾病，發病率為(5～30)/10萬[7]。大血管受到諸如血管活性物質、血壓和血流剪切力變化刺激，易發生血管重構，即血管為適應和修復損傷,血管壁成分發生改變，包括血管內皮細胞增殖、平滑肌細胞凋亡、平滑肌細胞和巨噬細胞遷移等過程[8-9]。TGF-β信號系統激活可能導致細胞生長失控，從而引起增生性細胞疾病的發生[10]。本實驗旨在觀察TGF-β信號傳導變化對體外培養的人主動脈平滑肌細胞遷移及凋亡的調控作用。

本研究結果顯示，當TGF-β信號傳導通路中的核心組分SMAD表達下調后，該通路信號被異常活化，HASMC的抗血管緊張素刺激能力顯著下降，細胞易發生凋亡；而當TGF-β信號傳導受阻抑之后，HASMC遷移能力增強。TGF-β信號通路過表達可引起牛腎小球毛細血管細胞、視網膜內皮細胞和人臍靜脈內皮細胞等不同類型細胞的凋亡[11]。Lu等[12]研究證實TGF-β可引起肺毛細血管內皮細胞凋亡，這種作用是依賴于ALK5-SMAD通路的激活和抗凋亡基因Bcl-2表達的下調。在人和大鼠肝臟上皮細胞系中，TGF-β通過線粒體激活Caspase-3,導致促進凋亡的蛋白Bad裂解為有活性的蛋白片段[13]。相關研究表明，完整的TGF-β/SMAD通路的作用可能與促進細胞外基質合成[12]、維持主動脈壁的穩態[14]以及維持HASMC的正常功能有關。TGF-β信號通路轉導受阻和TGF-β信號高表達兩者在致病過程中存在因果關系和協同作用，兩者的協同作用使血管壁結構和功能的穩定性遭到破壞，由此可能引發主動脈瘤的形成。

綜上所述，TGF-β信號轉導通路中的關鍵分子SMAD4表達下調可顯著促進HASMC遷移和凋亡，并可促進Caspase-3降解。本研究有助于揭示以血管功能與結構病理改變為基礎的胸主動脈瘤或夾層的發病機制。

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