mTIGIT-mLumin跨膜融合蛋白慢病毒載體和真核表達載體的構建及體外的穩定表達

王晶哲， 王小鈴， 王娟， 楊鑫鑫， 閆美娜， 李欣悅， 王薈， 劉霞， 邵啟祥

(江蘇大學醫學院， 江蘇 鎮江 212013)

T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM)結構域蛋白(T cell Ig and ITIM domin，TIGIT)是近年來新發現的具有免疫抑制作用的共刺激分子，是NK和T細胞共有的抑制性受體[1]；其是由244個氨基酸殘基組成的Ⅰ型跨膜蛋白，含有一個IgV樣結構域的胞外段、一個跨膜區及一個含ITIM的胞內段[2]。TIGIT能夠與CD226競爭結合脊髓灰質炎病毒受體(poliovirus receptor，PVR，即CD155)從而抑制T細胞的活化，TIGIT與PVR結合的親和力遠高于CD226。PVR主要表達于腫瘤細胞和抗原提呈細胞表面[3-4]。TIGIT與樹突狀細胞表面的PVR結合后促進IL-10表達，抑制IL-12(p40)表達[5]。研究表明，TIGIT與自身免疫性腦脊髓炎(EAE)等多種自身免疫性疾病有關[6]。研究發現PD-1/PDL-1/2抗體治療會出現耐藥，而耐藥的主要原因是腫瘤微環境表達大量的TIGIT等負向調節分子[7-8]，因此深入闡明TIGIT等分子的生物學功能，研發其阻斷型抗體進行臨床腫瘤治療就顯得尤為迫切。

mLumin是華中科技大學武漢國家光電實驗室(籌)駱清銘和張智紅教授通過基因重組構建的一種新型的紅色熒光蛋白，發射波長為621 nm[9]。mLumin的組織穿透能力強，并且光譜串擾比較小[10]，所以是一種良好的熒光蛋白。抗原表位對抗體的制備具有重要意義，本研究擬建立一個能夠用于蛋白質在細胞膜表面表達的通用載體，為此我們選擇TIGIT作為靶分子，構建其胞外序列、跨膜區和mLumin表達載體，為后期篩選陽性表達細胞、流式細胞術分選目標細胞奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠，6～8周，雄性，本校實驗動物中心提供，合格證號：No.201708296。

1.1.2 主要試劑和儀器 人腎上皮HEK-293T細胞為我院許文榮教授惠贈；非洲綠猴腎成纖維Cos7細胞由我院錢海老師惠贈，細胞培養于37 ℃，5% CO2和含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中。plenti-puro慢病毒質粒由本實驗室杜鳳移老師贈送；pcDNA3.1-mLumin紅色熒光蛋白質粒由華中科技大學武漢光電國家實驗室張智紅教授惠贈。PrimeSTAR DNA聚合酶、限制性內切酶(HindⅢ，BamHⅠ，XbaⅠ，XhoⅠ)、T4DNA連接酶、DL2000 DNA標準參照物和Trizol為TaKaRa公司產品；PCR引物、DNA膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒購自上海生工生物技術有限公司；LipfectamineTM2000 (Invitrogen公司)；S1000TMThermal Cycler PCR儀(Bio-Rad公司)；恒溫培養搖床QYC-211(上海福馬實驗設備有限公司)；熒光倒置顯微鏡(德國Zeiss公司)；TCS SP5Ⅱ共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 plenti-puro-mTIGIT-mLumin和pcDNA-mTIGIT-mLumin載體的構建與鑒定

1.2.1.1 mTIGIT胞外段、跨膜區和mLumin基因序列特異性引物設計 檢索NCBI數據庫(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)和Uniprot數據庫(http:∥www.uniprot.org/)，獲得小鼠mTIGIT胞外段及跨膜區的cDNA序列。搜索數據庫查找mLumin序列。按照序列設計引物后在NCBI數據庫上進行比對，根據載體上可用的限制性內切酶加于引物兩端并選擇特定的保護性堿基。

因為plenti-puro和pcDNA3.1的載體不同，根據載體酶切位點的不同設計2對mTIGIT特異性引物和mLumin特異性引物。合成的引物序列見表1(表中下劃線表示酶切位點)。

1.2.1.2 小鼠脾臟細胞RNA的提取 采用CO2麻醉處死C57BL/6小鼠，無菌眼科鑷剪取脾；用無菌 PBS沖洗后剪碎，并輕輕吹打，200目篩網過濾；PBS洗2次，棄上清液；加入紅細胞裂解液作用8 min；4 ℃，1 500 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，棄上清液；加入1 mL Trizol裂解細胞，按照說明書提取總RNA。

1.2.1.3 mTIGIT和mLumin序列的擴增、純化和回收 取脾細胞總RNA，反轉錄為cDNA，利用PCR技術獲得目的序列并回收。mLumin序列經PCR擴增后進行膠回收。

表1 mTIGIT基因和mLumin基因的PCR引物

1.2.1.4 目的基因與載體進行酶切、連接、轉化、篩選 將獲得的mLumin序列與對應的載體用限制性核酸內切酶進行雙酶切；經T4連接酶連接后轉入DH5α感受態擴增；搖床37 ℃振蕩12～16 h，提取質粒；再以提取的質粒為載體與mTIGIT序列進行雙酶切；再次連接之后轉入DH5α感受態擴增，提取質粒；將提取的質粒進行PCR鑒定和測序鑒定，利用PubMed數據庫進行分析對比。

1.2.2 重組質粒轉染細胞及熒光鑒定

1.2.2.1 熒光顯微鏡檢測plenti-puro-mTIGIT-mLumin重組質粒 將重組質粒與pspax、pMD2.0G(3 ∶2 ∶1)用無血清DMEM共轉染HEK293T細胞8～12 h，然后換成10%胎牛血清DMEM完全培養基，分別收取24 h和48 h的病毒上清液；再將病毒與含血清培養基按1 ∶1的比例加入新的HEK-293T細胞，感染24～48 h，用熒光顯微鏡檢測融合蛋白的表達。

1.2.2.2 共聚焦顯微鏡檢測pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin重組質粒 pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin重組質粒瞬時轉染Cos7細胞(方法同“1.2.2.1”)，48 h之后加入G418至1 mg/mL，篩選獲取陽性克隆，并在共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的表達。

2 結果

2.1 mTIGIT和mLumin基因的克隆

針對plenti-puro載體設計mTIGIT和mLumin的PCR擴增產物長度分別為689 bp和751 bp，酶切位點分別為HindⅢ、BamHⅠ和XbaⅠ。針對pcDNA3.1載體的產物長度分別為689 bp和746 bp，酶切位點分別為BamHⅠ，XhoⅠ和XbaⅠ。經瓊脂糖凝膠電泳顯示，出現的目的條帶位置與預期一致。表明PCR擴增的基因克隆正確，見圖1。

M：DNA標準參照物；N：空白對照；T：mTIGIT擴增產物；L：mLumin擴增產物；A：mTIGIT(plenti-puro載體)；B：mLumin(plenti-puro載體)；C：mTIGIT(pcDNA3.1載體)；D：mLumin(pcDNA3.1載體)

2.2 plenti-puro-mTIGIT-mLumin和pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質粒的構建與鑒定

2.2.1 plenti-puro-mTIGIT質粒的構建與鑒定 經瓊脂糖電泳鑒定以及測序結果對比分析，plenti-puro-mTIGIT-mLumin質粒構建成功(圖2)。

2.2.2 pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質粒的構建與鑒定 經瓊脂糖電泳檢測和測序結果比對分析，證實pcDNA3.1-mTIGIT-mLumin質粒構建成功。見圖3。

2.3 兩種載體均能很好地表達于目的細胞胞膜

目的基因mTIGIT-mLumin融合蛋白定位于細胞膜表面，而只攜帶mLumin基因的質粒其蛋白則表達于整個細胞(為了可以與陽性對照進行對比，圖片拍于未用puromycin篩選前)。見圖4。

利用熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡進行觀察，確認mTIGIT-mLumin融合蛋白成功表達于Cos7細胞表面。見圖5。

M：DNA標準參照物；P：載體酶切產物；T-L：mTIGIT-mLumin融合基因；A：plenti-puro載體的雙酶切產物電泳圖；B：mTIGIT-mLumin融合基因陽性質粒酶切鑒定結果；C：mTIGIT-mLumin融合基因陽性質粒PCR鑒定結果；D：測序結果

M：DNA標準參照物；P：載體酶切產物；T-L：mTIGIT-mLumin融合基因；A：pcDNA3.1載體的雙酶切電泳圖；B：mTIGIT-mLumin融合基因陽性質粒PCR鑒定結果

圖4 對照質粒及plenti-puro-mTIGIT-mLumin質粒轉染細胞結果(200×)

3 討論

近來CAR-T和PD-1/PDL-1抗體的免疫生物治療取得了突破性進展，淋巴瘤治療總體有效率達到50%～60%[1-2]。但在治療中出現了耐PD-1/PDL-1抗體的現象，通過深入研究發現這些患者的腫瘤微環境表達大量的TIGIT、LAG3和TIM3等[8]。TIGIT主要表達于NK和T細胞，其抑制NK細胞毒作用，引起T細胞的耗竭和增強Treg的功能[11-12]。研究證明抑制TIGIT有利于促進抗腫瘤免疫治療[11,13]。共同阻斷PD-1和TIGIT時，能明顯恢復其抗腫瘤的CD8+T細胞的活性[14]。

圖5 重組質粒融合蛋白的表達

以往抗體的制備除了采用天然抗原外，還采用基因工程蛋白作為抗原的主要來源，而抗體的產生與抗原的功能性表位密切相關。目前基因工程表達的蛋白多來源于原核的工程菌，缺乏糖基化，而糖基化對抗原決定簇的性質影響很大，故導致許多表位的缺失。即使采用畢赤酵母等進行表達，其添加的寡糖只有甘露糖殘基，而動物和人等高等真核生物的寡糖組成有N-乙酰氨基半乳糖、半乳糖和唾液酸等。此外，在對糖基化蛋白選擇上，畢赤酵母與高等真核生物也有很多不同，有些蛋白在天然宿主中并不會被糖基化，但畢赤酵母卻能使這些蛋白糖基化。而有些蛋白在天然宿主中被糖基化，但在畢赤酵母中其絲氨酸和蘇氨酸未糖基化，因此其表達的抗原特異性也與原宿主蛋白有很大的差異。再者即使是原宿主來源蛋白，如果經過變性處理，特別是甲醛等處理，容易導致蛋白質間基團的交聯，隨著空間結構的改變其抗原特異性也部分發生改變。本研究建立了以mLumin熒光蛋白為指示系統的跨細胞膜蛋白表達載體，既可以表達蛋白，又可指示蛋白質是否能表達于細胞膜表面，還有利于采用流式細胞術分選。此外，該表達系統能高效表達TIGIT跨膜區及胞外段蛋白，mLumin熒光蛋白起到了很好的指示效果。

[ 1 ] Zheng JM, Cui JL, He WT, et al. Construction and characterization of recombinant adenovirus carrying a mouse TIGIT-GFP gene[J]. Genet Mol Res, 2015, 14(4)：18650-18651.

[ 2 ] 方亮, 陳麗華, 金伯泉. 一種新的免疫抑制性受體TIGIT[J]. 細胞與分子免疫學雜志, 2012, 28(1): 108-110.

[ 3 ] Sakisaka T, Takai Y. Biology and pathology of nectins and nectin-like molecules[J]. Curr Opin Cell Biol, 2004, 16(5): 513-521.

[ 4 ] Fuchs A, Colonna M. The role of NK cell recognition of nectin and nectin-like proteins in tumor immunosurveillance[J]. Semin Cancer Biol, 2006, 16(5): 359-366.

[ 5 ] Yu X, Harden K, Gonzalez LC, et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells[J]. Nat Immunol, 2009, 10(1): 48-57.

[ 6 ] Joller N, Hafler JP, Brynedal B, et al. Cutting edge: TIGIT has T cell-intrinsic inhibitory functions[J]. J Immunol, 2011, 186(3): 1338-1342.

[ 7 ] Ma Y, Yang H, Pitt JM, et al. Therapy-induced microenvironmental changes in cancer[J]. J Mol Med (Berl), 2016, 94(5): 497-508.

[ 8 ] Nowicki TS, Hu-Lieskovan S, Ribas A. Mechanisms of resistance to PD-1 and PD-L1 blockade[J]. Cancer J, 2018, 24(1): 47-53.

[ 9 ] 樊晉宇, 崔宗強, 張先恩. 紅色熒光蛋白的光譜多樣性及體外分子進化[J]. 生物化學與生物物理進展, 2008, 35(10): 1112-1120.

[10] Chu J, Zhang Z, Zheng Y, et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions[J]. Biosens Bioelectron, 2009, 25(1): 234-239.

[11] Blake SJ, Dougall WC, Miles JJ, et al. Molecular pathways: Targeting CD96 and TIGIT for cancer immunotherapy[J]. Clin Cancer Res, 2016, 22(21): 5183-5188.

[12] Manieri NA, Chiang EY, Grogan JL. TIGIT: a key inhibitor of the cancer immunity cycle[J]. Trends Immunol, 2017, 38(1): 20-28.

[13] Callahan MK, Postow MA, Wolchok JD. Targeting T cell co-receptors for cancer therapy[J]. Immunity, 2016, 44(5): 1069-1078.

[14] Johnston R J, Comps-Agrar L, Hackney J, et al. The immunoreceptor TIGIT regulates antitumor and antiviral CD8+T cell effector function[J]. Cancer Cell, 2014, 26(6): 923-937.