HMGB2啟動子報告基因載體的構建、活性驗證及與其結合的轉錄因子的預測

王飛， 馮奇， 秦杰， 李婉， 盧春

(南京醫科大學病原生物學系， 江蘇 南京 211166)

高遷移率族蛋白(high mobility group，HMG)于1973年被發現，因其特殊的溶解性和在SDS-PAGE中的高遷移率而得名。HMG蛋白是含量僅次于組蛋白的染色質蛋白，分布在細胞核內，主要行使調節染色質結構的功能；此外，它還參與轉錄、染色質重組和DNA修復等細胞生物學過程[1-2]。HMG蛋白根據其同源性可進一步分為HMGA、HMGB、HMGN 3個家族[3]，其中HMGB家族的HMGB1和HMGB2具有很高的同源性。研究顯示，HMGB1蛋白參與調節免疫系統功能及炎癥反應，促進多種腫瘤形成與血管生成[4-5]。近來研究發現HMGB2在乳腺癌、惡性膠質瘤和肝癌[6]等多種腫瘤中呈高表達，且在腫瘤的發生和發展過程中起重要作用[7-9]。啟動子是具有調節功能的DNA序列，位于基因5′端上游，具有可以與反式作用因子結合的順式作用元件結構。啟動子就像“開關”，能夠活化RNA聚合酶并使之與模板DNA準確結合，起始轉錄，其本身并不影響基因的表達，而是通過與轉錄因子結合而控制基因轉錄起始[10-14]。

本研究擬構建含有HMGB2啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質粒，并對其進行功能活性鑒定。同時，通過軟件分析預測可能與HMGB2啟動子序列結合的轉錄因子，為進一步研究調控HMGB2基因轉錄活性的轉錄因子提供依據。

1 材料與方法

1.1 質粒和細胞

pGL3-Basic、pCMV6-Entry-C-Flag、pCMV6-Entry-C-Flag-p53和海腎熒光素酶報告質粒pRL-TK為本實驗室保存。本實驗所使用的細胞包括人胚腎上皮細胞(293T細胞)和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，分別培養在含有10%和20%血清(美國Gibco公司)的DMEM(美國Gibco公司)中；培養基中含10 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素，所有細胞均培養在37 ℃、5%CO2條件下的恒溫培養箱中。

1.2 試劑

本實驗所用的PCR引物由南京擎科生物科技有限公司合成；PCR高保真酶(Fanta酶)購自南京諾唯贊科技有限公司；血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒及感受態大腸埃希菌DH5α購自北京天根生化科技有限公司；質粒小提試劑盒及凝膠純化試劑盒(美國Omega公司)；限制性內切酶XhoⅠ和KpnⅠ(日本TaKaRa公司)；T4DNA連接酶(美國Thermo Scientific公司)；質粒轉染試劑LipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)；Dual-Glo Luciferase Assay System(美國Promega公司)；p53抗體(美國Santa Cruz公司)；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG購自南京巴傲得生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全基因組DNA的提取 提取HUVECs的全基因組DNA作為HMGB2啟動子區域序列PCR擴增的模板。首先，選取匯合度為80%的HUVECs，經胰酶消化后，用含有20%血清的完全DMEM終止消化，室溫800×g離心5 min，棄上清液；PBS重懸后再次離心棄上清液，根據血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取HUVECs基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增HMGB2啟動子序列 在NCBI Genbank數據庫中查詢HMGB2啟動子序列，設計PCR擴增引物。上游引物：5′-CGGGGTACCACCAAAGAGCATAGTCTTAACATGTGCCAA-3′(下劃線部分為保護性堿基，斜體部分為KpnⅠ限制性核酸內切酶識別序列)，下游引物：5′-CCGCTCGAGCC-CCAAATGCCGCTCGC-3′(下劃線部分為保護性堿基，斜體部分為XhoⅠ限制性核酸內切酶識別序列)。以提取的HUVECs全基因組DNA為模版，PCR擴增HMGB2啟動子序列，通過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物條帶在正確的位置后，進行切膠回收純化。

1.3.3 pGL3-HMGB2-promoter質粒的構建及鑒定 將上述切膠回收產物和pGL3-Basic質粒分別用KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切后，進行瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收純化和T4連接酶連接。將連接產物轉化感受態大腸埃希菌DH5α，涂布于具有氨芐西林抗性的LB平板，37 ℃培養過夜。次日，隨機挑選單克隆菌落于LB培養基中振蕩培養、大量擴增并提取質粒。將提取的重組質粒進行雙酶切鑒定，同時，測定核酸序列，并利用APE軟件比對測序結果。

1.3.4 蟲熒光素酶報告實驗檢測p53對HMGB2啟動子活性的影響 將293T細胞接種在48孔板中，次日，使用LipofectamineTM2000將pGL3-HMGB2-promoter重組質粒、pGL3-Basic空載體分別與pCMV6-Entry-C-Flag-p53、pCMV6-Entry-C-Flag以及內參pRL-TK質粒共轉入293T細胞，pCMV6-Entry-C-Flag-p53質粒與空載質粒pCMV6-Entry-C-Flag以及pGL3-HMGB2-promoter重組質粒與其空載質粒pGL3-Basic的質量比為4 ∶1。24 h后，根據Dual-Glo Luciferase Assay System試劑盒說明書檢測相應組別的熒光素酶活性，每組相對熒光素酶活性的值等于每組中每個獨立實驗的蟲熒光素酶與海腎熒光素酶檢測值比值的平均值。

1.3.5 蛋白質免疫印跡法檢測p53蛋白的表達 收集“1.3.4”中重組質粒pGL3-HMGB2-promoter分別共轉染pCMV6-Entry-C-Flag-p53和pCMV6-Entry-C-Flag的293T細胞，提取總蛋白，取100 μg樣品進行SDS-PAGE并轉膜；經5%脫脂牛奶封閉1 h后，將PVDF膜孵育在p53和內參GAPDH的一抗中(稀釋比為1 ∶500)，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次5 min。用相應的二抗37 ℃孵育1 h后(稀釋比為1 ∶10 000)；TBST洗膜3次，每次5 min，于化學發光儀下顯影。

1.3.6 與HMGB2啟動子結合的轉錄因子的預測 將HMGB2啟動子序列輸入在線軟件PROMO(http:∥alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)中，根據網站提示進行操作，輸出可以與HMGB2啟動子序列結合的轉錄因子的預測結果。

1.4 統計學方法

使用統計學軟件SPSS 19.0對數據進行統計分析，兩兩比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 pGL3-HMGB2-promoter重組質粒的構建及鑒定

通過查詢NCBI數據庫以及相關資料，獲得HMGB2啟動子的范圍，為HMGB2 mRNA轉錄起始位點上游-1 379 bp到下游+292 bp的位置。根據該序列設計擴增引物，以HUVECs全基因組DNA為模版進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，擴增片段約1 684 bp，與目標DNA長度一致(圖1)。

M：DNA標準參照物；1：HMGB2基因啟動子擴增產物

對pGL3-HMGB2-promoter重組質粒進行KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，結果可見2條特異性片段，分別約為4 817 bp(載體片段)和1 684 bp(HMGB2啟動子片段，圖2a)。重組質粒測序比對結果顯示，插入的HMGB2啟動子序列與理論序列一致(圖2b)，表明pGL3-HMGB2-promoter重組質粒構建成功。

M：DNA標準參照物；1：重組質粒pGL3-HMGB2-promoter雙酶切產物;A: 重組質粒pGL3-HMGB2-promoter的雙酶切鑒定；B: 重組質粒部分測序結果

2.2 pGL3-HMGB2-promoter重組質粒活性的驗證

蟲熒光素酶報告實驗結果顯示，pGL3-HMGB2-promoter報告質粒的活性明顯高于pGL3-Basic對照組(t=4.587，P<0.01，圖3)，表明pGL3-HMGB2-promoter質粒具有轉錄活性。

a：P<0.01，與pGL3-Basic比較

2.3 p53對HMGB2啟動子活性的影響

免疫印跡結果證實，pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉染組成功過表達p53；蟲熒光素酶報告實驗結果顯示，過表達p53的pGL3-HAGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag-p53共轉染組重組質粒的蟲熒光素酶活性明顯低于pGL3-HMGB2-promoter+pCMV6-Entry-C-Flag共轉染組(圖4)。由此進一步說明本實驗構建的pGL3-HMGB2-promoter報告質粒具有轉錄活性。

2.4 與HMGB2啟動子結合的轉錄因子的預測

運用在線軟件PROMO對HMGB2啟動子區域(-1 379 bp～+292 bp)進行分析，預測出72個可能與HMGB2啟動子序列結合的轉錄因子，其中TFIID[16]、LEF-1[17-18]、POU2F2(Oct-2)[19]、NFI/CTF[20]、FOXP3[21]、STAT4[22]等與腫瘤發生發展密切相關(表1)。這些轉錄因子的預測為我們進一步探索調控HMBG2表達的分子機制奠定了基礎。

表1 HMGB2啟動子轉錄因子結合位點的部分預測結果

1：pCMV6-Entry-C-Flag; 2:pCMV6-Entry-C-Flag-p53

3 討論

先前的研究發現，HMGB2可與雌激素受體結合，競爭性抑制內分泌治療藥物對乳腺癌的治療作用，促進乳腺癌的發展[9]。另外，HMGB2可以通過調控p53的表達增強腫瘤細胞的生存、侵襲能力以及對化療藥物的拮抗作用，從而促進骨肉瘤、惡性膠質瘤的發生與發展[23-24]。另有研究表明，HMGB2可以促進Oct4的小泛素相關修飾物(SUMO)化，從而抑制其被磷酸化降解，進一步激活AKT通路，促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[25]。

本研究擴增了HMGB2啟動子所在區域的DNA片段，成功構建了含有HMGB2啟動子序列的熒光素酶報告基因重組質粒。p53可通過結合HMGB2啟動子區抑制其轉錄[15]，本實驗所構建的pGL3-HMGB2-promoter報告質粒活性能夠被p53抑制，與之一致。該質粒的構建有助于尋找能夠與HMGB2啟動子結合并促進HMGB2表達的轉錄因子，進而闡明HMGB2參與腫瘤發生發展過程的具體分子機制。

通過在線軟件PROMO對HMGB2啟動子序列進行分析預測，獲得72個可能作用于HMGB2的轉錄因子，其中p53已被報道可以轉錄調控HMGB2[15]。另外，預測結果中的許多轉錄因子可以與HMGB2直接結合，或者受HMGB2調控從而影響其行使轉錄功能。例如，HMGB2可以促進轉錄因子TFⅡD-TFⅡA與其調控的目的基因的啟動子區結合從而促進下游基因的轉錄[26]。HMGB2可以促進轉錄因子Lef-1的表達及其與β-catenin復合物的形成，進而誘導下游基因的表達[17-18]。HMGB2還可以通過促進轉錄因子Oct2的表達，抑制正常B淋巴細胞的分化、維持B淋巴瘤細胞的存活導致B淋巴瘤的發生[19, 27]。這些轉錄因子是否能夠調控HMGB2轉錄，目前尚不清楚。我們下一步將以這些可能作用于HMGB2啟動子區域的轉錄因子為基礎，探究其在HMGB2轉錄過程中的作用，從而有助于闡明HMGB2參與腫瘤發生發展的具體機制。

[ 1 ] Thomas JO, Travers AA.HMG1 and 2, and related ‘architectural’ DNA-binding proteins[J]. Trends Biochem Sci, 2001, 26(3): 167-174.

[ 2 ] Reeves R. Nuclear functions of the HMG proteins[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1799(1/2): 3-14.

[ 3 ] Bustin M,Reeves R.High-mobility-group chromosomal proteins:architectural components that facilitate chromatin function[J]. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1996, 54: 35-100.

[ 4 ] Bianchi ME, Manfredi AA. High-mobility group box 1(HMGB1) protein at the crossroads between innate and adaptive immunity[J]. Immunol Rev, 2007, 220: 35-46.

[ 5 ] Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation[J]. Nature, 2002, 418(6894): 191-195.

[ 6 ] Kwon JH, Kim J, Park JY, et al. Overexpression of high-mobility group box 2 is associated with tumor aggressiveness and prognosis of hepatocellular carcinoma[J]. Clin Cancer Res, 2010, 16(22): 5511-5521.

[ 7 ] Zhao XL, Lin Y, Jiang J, et al. High-mobility group box 1 released by autophagic cancer-associated fibroblasts maintains the stemness of luminal breast cancer cells[J]. J Pathol, 2017, 243(3): 376-389.

[ 8 ] Taniguchi N, Caramés B, Hsu E, et al. Expression patterns and function of chromatin protein HMGB2 during mesenchymal stem cell differentiation[J]. J Biol Chem, 2011, 286(48): 41489-41498.

[ 9 ] Redmond AM, Byrne C, Bane FT, et al. Genomic interaction between ER and HMGB2 identifies DDX18 as a novel driver of endocrine resistance in breast cancer cells[J]. Oncogene, 2015, 34(29): 3871-3880.

[10] McGhee JD, Krause MW. Transcription factors and transcriptional regulation[M]. Riddle DL, Blumenthal T, Meyer BJ, et al.C.elegansⅡ. 2nd. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997:117-184.

[11] Trinklein ND, Aldred SJ, Saldanha AJ, et al. Identification and functional analysis of human transcriptional promoters[J]. Genome Res, 2003, 13(2): 308-312.

[12] Davuluri RV, Grosse I, Zhang MQ. Computational identification of promoters and first exons in the human genome[J]. Nat Genet, 2001, 29(4): 412-417.

[13] Down TA, Hubbard TJ. Computational detection and location of transcription start sites in mammalian genomic DNA[J]. Genome Res, 2002, 12(3): 458-561.

[14] Ohler U, Niemann H. Identification and analysis of eukaryotic promoters: recent computational approaches[J]. Trends Genet, 2001, 17(2): 56-60.

[15] Shin YJ, Kim MS, Kim MS, et al. High-mobility group box 2 (HMGB2) modulates radioresponse and is downregulated by p53 in colorectal cancer cell[J]. Cancer Biol Ther, 2013, 14(3): 213-221.

[16] Coleman RA, Qiao Z, Singh SK, et al. p53 dynamically directs TFⅡD assembly on target gene promoters[J]. Mol Cell Biol, 2017, 37(13): pii:e00085-17.

[17] Taniguchi N, Kawakami Y, Maruyama I, et al. HMGB proteins and arthritis[J]. Hum Cell, 2018, 31(1): 1-9.

[18] Taniguchi N, Caramés B, Kawakami Y, et al. Chromatin protein HMGB2 regulates articular cartilage surface maintenance via β-catenin pathway[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009, 106(39): 16817-16822.

[19] Hodson DJ, Shaffer AL, Xiao W, et al. Regulation of normal B-cell differentiation and malignant B-cell survival by OCT2[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2016, 113(14): E2039-E2046.

[20] Quesnelle KM, Grandis JR. Dual kinase inhibition of EGFR and HER2 overcomes resistance to cetuximab in a novelinvivomodel of acquired cetuximab resistance[J]. Clin Cancer Res, 2011, 17(18): 5935-5944.

[21] Yang S, Liu Y, Li MY, et al. FOXP3 promotes tumor growth and metastasis by activating Wnt/β-catenin signaling pathway and EMT in non-small cell lung cancer[J]. Mol Cancer, 2017, 16(1): 124.

[22] Zhao L, Ji G, Le X, et al. An integrated analysis identifies STAT4 as a key regulator of ovarian cancer metastasis[J]. Oncogene, 2017, 36(24): 3384-3396.

[23] Wu ZB, Cai L, Lin SJ, et al. High-mobility group box 2 is associated with prognosis of glioblastoma by promoting cell viability, invasion, and chemotherapeutic resistance[J]. Neuro Oncol, 2013, 15(9): 1264-1275.

[24] Stros M, Ozaki T, Bacikova A, et al. HMGB1 and HMGB2 cell-specifically down-regulate the p53- and p73-dependent sequence-specific transactivation from the human Bax gene promoter[J]. J Biol Chem, 2002, 277(9): 7157-7164.

[25] Campbell PA, Rudnicki MA. Oct4 interaction with Hmgb2 regulates Akt signaling and pluripotency[J]. Stem Cells, 2013, 31(6): 1107-1120.

[26] Shykind BM, Kim J, Sharp PA. Activation of the TFIID-TFIIA complex with HMG-2[J]. Genes Dev, 1995, 9(11): 1354-1365.

[27] Zwilling S, K?nig H, Wirth T. High mobility group protein 2 functionally interacts with the POU domains of octamer transcription factors[J]. EMBO J, 1995, 14(6): 1198-1208.